蔡曉陽 徐利民 陳慶煌 趙春安

1. 國立華僑大學(xué)醫(yī)院骨科，福建 泉州 362011 2. 四川省隆昌縣人民醫(yī)院，四川 內(nèi)江 642150 3. 泉州市福建醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，福建 泉州 362011

軟骨損傷是全球常見的健康問題，由于供體材料稀缺、容易退變等問題導(dǎo)致軟骨修復(fù)成為骨科領(lǐng)域的重點(diǎn)難題。隨著組織工程的發(fā)展，軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)已經(jīng)取得了一系列有價(jià)值的成果[1,2]。然而，軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)與體內(nèi)的軟骨結(jié)構(gòu)存在很大不同，其中一個(gè)關(guān)鍵的差異為缺乏細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的生物相容性支架，它為種子細(xì)胞的粘附、遷移和分化提供三維物理支持，導(dǎo)致單層培養(yǎng)物中暴露的軟骨細(xì)胞易于脫分化，喪失其原始基因表達(dá)譜和表型，最終在研究軟骨病的發(fā)病機(jī)制和治療中失去應(yīng)用價(jià)值[3,4]。近年來，不少學(xué)者已經(jīng)在軟骨組織工程中開發(fā)和測(cè)試了許多支架[5,6]，然而截止到目前尚沒有發(fā)現(xiàn)一種理想的支架。本研究中，我們將高度多孔的松質(zhì)骨BMG作為組織工程軟骨載體，探討其負(fù)載兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞來進(jìn)行軟骨修復(fù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 松質(zhì)骨BMG的制備

根據(jù)Wang等[7]報(bào)道的一些修改方法制備了BMG。從新鮮安樂死的成年新西蘭白兔收獲肱骨，去除所有軟組織和骨髓，并用無菌去離子水洗滌骨骼。然后將清潔的骨骼在磁力攪拌器中進(jìn)行以下連續(xù)步驟：(1)室溫下將骨骼浸置于氯仿-甲醇(1∶1)混合液中過夜以除去脂質(zhì)；(2)在4 ℃下浸置于0.6 M鹽酸中軟化12～36 h，得到不同的機(jī)械強(qiáng)度骨骼；(3)在4 ℃下用2 M CaCl2洗滌2 h以提取較低分子量的蛋白質(zhì)多糖；(4)在4 ℃下用0.5 M EDTA洗滌2 h以去除非分散鈣和提取蛋白質(zhì)多糖；(5)在4 ℃下用8 M LiCl洗滌以收縮膠原纖維，并提取高分子量蛋白質(zhì)多糖；(6)在55 ℃下用去離子水洗滌2 h以提取骨膠的可溶性部分。在每個(gè)步驟之間，骨材料用無菌去離子水洗滌。將制備好的BMG切成直徑為3 mm的球形，用環(huán)氧乙烷滅菌并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中以備使用。

1.2 BMG的表征

制備的BMG在BX51-P光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯公司)下拍照觀察，并通過s570掃描電子顯微鏡(HITACHI公司)分析BMG超微結(jié)構(gòu)的表征。

1.3 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

無菌環(huán)境下從1個(gè)月大的新西蘭白兔的髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)和肩關(guān)節(jié)獲得關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，并置于含有雙抗的D-Hank溶液中。將軟骨樣品切成糊狀，在37 ℃環(huán)境下依次在0.05%透明質(zhì)酸酶、0.2%胰蛋白酶和0.2%膠原酶II型中消化10 min、30 min和1 h。然后使用尼龍網(wǎng)過濾器過濾細(xì)胞懸浮液，將得到的濾液以65 g離心10 min，去掉上清，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于改良的Eagle培養(yǎng)基(含30%胎牛血清和雙抗)。將軟骨細(xì)胞(5×105個(gè))接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，在5%CO2、37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2天更換一次。

1.4 松質(zhì)骨BMG和軟骨細(xì)胞復(fù)合體的構(gòu)建

取培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，在0.2%胰蛋白酶中消化10 min，4℃65 g離心10 min，棄上清，取軟骨細(xì)胞(2×106)重懸于100 μL Eagle培養(yǎng)基中，接種到已經(jīng)放置在10 mL離心管底部的松質(zhì)骨BMG上。接種30 min后，將4 mL Eagle培養(yǎng)基小心地加入到軟骨細(xì)胞-松質(zhì)骨BMG復(fù)合體中。繼續(xù)培養(yǎng)復(fù)合體7 w，培養(yǎng)基每3 天更換一次。

1.5 組織工程軟骨的組織學(xué)觀察

分別在培養(yǎng)第1、4、7 w時(shí)獲取工程軟骨組織(n=5)，用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，用石蠟包埋。切成5 μm的薄片，用蘇木精和曙紅(HE)進(jìn)行整體染色，用甲苯胺藍(lán)染色觀察蛋白聚糖表達(dá)，免疫組化染色觀察I型和II型膠原蛋白的表達(dá)。隨機(jī)選取1、4、7 w每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的5個(gè)切片，計(jì)算出整個(gè)組織工程軟骨中新形成的軟骨組織的百分比。在整個(gè)工程組織中新形成的軟骨組織的百分比=(新形成的軟骨/整體工程組織)×100%。

蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達(dá)用Image Pro-Plus 5.1圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。隨機(jī)選取培養(yǎng)1、4、7 w每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的5個(gè)切片。掃描和分析每個(gè)部分的六個(gè)膠原蛋白或蛋白聚糖表達(dá)。所得到的灰度值表示掃描場的透射光強(qiáng)度,較高的灰度值表示該部分的色素沉著減少，這表明蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達(dá)水平較低。平均灰度值=所有灰度值總和÷總面積。平均灰度值越低，陽性表達(dá)水平越強(qiáng)烈。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 松質(zhì)骨BMG的表征

圖3 松質(zhì)骨BMG和軟骨細(xì)胞復(fù)合體構(gòu)建過程的組織學(xué)表現(xiàn)。(a)、(b)、(c)為HE染色，(d)、(e)、(f)為蛋白聚糖甲苯胺藍(lán)染色(紫色表達(dá)為陽性)，(g)，(h)，(i)-II型膠原免疫染色(橙色表達(dá)為陽性)；(a)、(d)、(g)-1 w，(b)、(e)、(h)-4 w，(c)、(f)、(i)-7 wFig.3 Histological observation of chondrocytes cultured on the cancellous BMG. (a), (b), (c) HE staining; (d), (e), (f) Proteoglycan toluidine blue staining (positive expression was purple); (g), (h), (i) Type II collagen immunostaining (positive expression was orange); (a), (d), (g): At week 1; (b), (e), (h) At week 4; (c), (f), (i) At week 7

制備的松質(zhì)骨BMG是多孔的，它可以輕易地修剪成不同的尺寸和輪廓，例如3 mm的球形(圖1)。掃描電子顯微鏡下觀察到在100～400 μm范圍內(nèi)的松質(zhì)骨BMG中的通孔(圖2 a)，當(dāng)軟骨細(xì)胞-松質(zhì)骨BMG復(fù)合體培養(yǎng)24 h后，軟骨細(xì)胞均牢固地附著在松質(zhì)骨BMG表面和微孔上，形成互連和集群(圖2b)。

圖1 松質(zhì)骨BMG的代表性宏觀圖像Fig.1 Macroscopic images of the cancellous BMG

2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果

培養(yǎng)第1周時(shí)，HE染色顯示，松質(zhì)骨BMG周圍的軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，大多數(shù)軟骨細(xì)胞顯示出紡錘狀形態(tài)(圖3 a)。甲苯胺藍(lán)和免疫組織化學(xué)染色表明，在BMG支架上的接種的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白聚糖(圖3 d)和II型膠原(圖3 g)。

培養(yǎng)第4周時(shí)，在BMG表面形成軟骨組織，較多的軟骨細(xì)胞在BMG的中心區(qū)域生長(圖3b)。同時(shí)，BMG支架結(jié)構(gòu)中合成的基質(zhì)對(duì)軟骨細(xì)胞特異性蛋白聚糖(圖3e)和II型膠原(圖3 h)染色明顯增強(qiáng)。

培養(yǎng)第7周時(shí)，BMG表面形成的軟骨組織的厚度沒有明顯增加，但軟骨細(xì)胞在BMG內(nèi)部明顯增殖，軟骨組織形成于松質(zhì)骨BMG的整個(gè)孔中(圖3c)。軟骨細(xì)胞富含蛋白聚糖(圖3f)和II型膠原(圖3i)均勻分布在BMG周圍，同時(shí)松質(zhì)骨BMG由于收縮或降解很難辨別。在第1、4、7 w均沒有觀察到Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。

2.3 軟骨組織形成和蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)情況

使用Image J分析軟骨中新形成的軟骨組織的百分比。培養(yǎng)時(shí)間為1、4、7 w，新形成的軟骨組織百分比分別為(11.43±2.16)%、(27.41±4.42) %和(44.89±6.05) %，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，軟骨組織的形成顯著增加(圖4)。

軟骨中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)的半定量分析顯示，培養(yǎng)時(shí)間為1、4、7 w，Ⅱ型膠原蛋白的平均灰度值分別為153.62±6.37、135.49±7.05和120.18±5.34，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；蛋白聚糖的平均灰度值分別為144.69±4.05、120.37±2.85、101.96±3.52，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，軟骨中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白含量呈顯著增加趨勢(shì)(圖5)。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間新形成的軟骨組織百分比注：與第1周相比，*P<0.05；與第4周相比，#P<0.05Fig.4 Percentage of newly formed cartilaginous tissue at different culture times

圖5 松質(zhì)骨BMG和軟骨細(xì)胞復(fù)合體產(chǎn)生的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的平均灰度值注：與第1周相比，*P<0.05；與第4周相比，#P<0.05Fig.5 Average gray value of proteoglycan and type II collagen produced by chondrocytes on the cancellous BMG

3 討論

組織工程軟骨的成功構(gòu)建需要合適的支架來促進(jìn)細(xì)胞增殖并維持分化表型。然而到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)理想的支架材料。軟骨組織工程的理想支架應(yīng)具備的特性有[8,9]：①顯著的低免疫原性和生物相容性；②良好的可降解性，具有可控的降解速率，以匹配新組織再生速度；③高度多孔，以促進(jìn)氣體交換，營養(yǎng)和代謝廢物擴(kuò)散；④具有機(jī)械穩(wěn)定性，以防止由于過早崩潰引起的新軟骨組織形成和關(guān)節(jié)處的外部應(yīng)力；⑤生產(chǎn)和儲(chǔ)存方便。

在本研究中，我們通過用稀鹽酸提取骨來去除礦物質(zhì)，然后用濃縮的CaCl2去除蛋白質(zhì)和多糖部分，并將LiCl作為變性劑收縮膠原纖維并將膠原轉(zhuǎn)化為不溶性骨明膠制備BMG。通過脫脂、去礦化和去蛋白質(zhì)多糖的方法制備的BMG，去除了95%的非膠原蛋白，消除BMG內(nèi)的抗原物質(zhì)，使其與宿主相比具有較弱的免疫原性的生物相容性。此外，如Zhang[10]等觀察到的，BMG制備過程保留了一定量的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和在異位植入試驗(yàn)中仍具有生物活性的其他軟骨形成因子。以往的研究表明，BMG可以在體外誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，并在體內(nèi)軟骨缺陷中形成透明樣軟骨[11]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是負(fù)責(zé)BMG潛在的軟骨誘導(dǎo)活性的主要因子。其中，BMP-2和BMP-7等已經(jīng)獲得較大突破，已被廣泛應(yīng)用于軟骨組織工程中，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，刺激蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達(dá)，維持分化狀態(tài)[12,13]。因此，當(dāng)細(xì)胞在BMG上培養(yǎng)時(shí)，埋藏在BMG中的BMP可以通過降解過程暴露和釋放，從而促進(jìn)永久性軟骨形成。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BMG在體內(nèi)被植入骨缺損時(shí)，在缺損部位招募的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)將受支架BMG及周圍環(huán)境的影響。當(dāng)存在成骨環(huán)境，例如足夠的血液供應(yīng)和合適的氧氣壓力時(shí)，軟骨細(xì)胞將變得肥大并進(jìn)一步分化成骨細(xì)胞[14,15]；當(dāng)沒有成骨環(huán)境，如體外組織工程實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于氧氣壓力相對(duì)較低，血液供應(yīng)不足，松質(zhì)骨BMG主要作為支架，支持軟骨細(xì)胞的三維生長，而不促進(jìn)進(jìn)一步成骨分化。因此，本研究中沒有在松質(zhì)骨BMG和軟骨細(xì)胞復(fù)合體中觀察到I型膠原表達(dá)。

BMG已經(jīng)被構(gòu)建成一個(gè)骨骼軟骨替代物，Bergen等[16]將第1代(P1)的原代軟骨細(xì)胞與皮質(zhì)BMG組合，結(jié)果皮質(zhì)BMG上產(chǎn)生具有層狀層的1.3 mm厚的透明樣軟骨，但是由于軟骨細(xì)胞很少滲透到內(nèi)部區(qū)域，導(dǎo)致軟骨外殼與皮質(zhì)BMG的整合較弱，最終使得該組織工程化的軟骨帽與基底的BMG支架分離并破碎，分析原因?yàn)槠覤MG的孔徑范圍為15 μm左右，而基于早期研究，根據(jù)細(xì)胞大小、遷移要求和物質(zhì)運(yùn)輸需求，支架孔徑的最小要求應(yīng)為100 μm[17]。因此，本研究中使用的松質(zhì)骨BMG是高度多孔的，內(nèi)部孔尺寸為100～400 μm，允許軟骨細(xì)胞生長到每個(gè)孔中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，軟骨組織的形成顯著增加，并且蛋白聚糖和膠原II型遍及松質(zhì)骨BMG的整個(gè)孔。上述結(jié)果提示松質(zhì)骨BMG可以為軟骨細(xì)胞增殖提供適宜的空間，有利于維持細(xì)胞表型，并促進(jìn)代謝物質(zhì)的交換。

此外，通過應(yīng)用不同的脫鹽時(shí)間和去礦化時(shí)間來獲得不同生物降解性和機(jī)械強(qiáng)度松質(zhì)骨BMG。研究中，在培養(yǎng)第6周時(shí)觀察到松質(zhì)骨BMG的明顯收縮或降解，與新軟骨組織的形成顯著同步。隨著這種優(yōu)異的生物降解性，松質(zhì)骨BMG可以為軟骨細(xì)胞增殖和蛋白聚糖及膠原II型沉積提供空間?；谄淇烧{(diào)節(jié)的機(jī)械強(qiáng)度，松質(zhì)骨BMG可以容易地修剪成所需的形狀和尺寸，以適應(yīng)不同的修復(fù)和再生缺陷，從而賦予骨科和牙科外科醫(yī)生能夠根據(jù)個(gè)體修復(fù)需要定制骨軟骨移植物。制備后，松質(zhì)骨BMG可以在低溫(-80 ℃)下長時(shí)間保存，對(duì)其生物活性沒有不利影響。

綜上所述，松質(zhì)骨BMG具有良好的生物相容性，可控的機(jī)械強(qiáng)度和降解速率，顯著的低免疫原性，高可用性和合適的孔隙率，所以是一種較理想的支架材料。