孫明曜 曾弈 沈彬*

1. 四川大學華西醫(yī)院，四川 成都 610041 2. 首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029

甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是一類能夠調節(jié)骨代謝的激素[1-2]。在臨床上，小劑量的甲狀旁腺素能夠有效預防和治療骨質疏松，無論是特立帕肽[PTH(1-34)，一段包含了34個氨基酸的PTH內源性片段]，還是全長的PTH(1-84)，都能夠有效減少骨質疏松骨折的風險[3-4]。另一方面，對于已經(jīng)發(fā)生了骨質疏松骨折的患者，間斷低劑量的使用PTH可以縮短骨折愈合的時間，改善愈合效果[5-7]，甚至對于部分骨缺損的修復，也有良好的促進效果[8-9]。

骨質疏松性骨折的風險不僅僅受骨密度影響，更取決于骨強度的變化。Ⅰ型膠原作為構成細胞外基質的主要成分，它的含量和排列結構密切影響著骨基質的質量、骨構架形成以及骨的強度[10]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在骨質疏松患者的骨組織中，Ⅰ型膠原含量有著不同程度的減低，其排列結構也變得紊亂[11-12]。故Ⅰ型膠原與骨質疏松及骨質疏松骨折之間有著密切的聯(lián)系。COL1A1是編碼Ⅰ型膠原α1鏈的基因。通過對COL1A1 mRNA轉錄水平的檢測，可以推測Ⅰ型膠原代謝的動態(tài)過程，并判斷Ⅰ型膠原含量的變化趨勢。所以COL1A1基因的檢測也是研究Ⅰ型膠原變化趨勢的一項重要手段。不過有關PTH對Ⅰ型膠原及COL1A1影響的研究，尤其在骨質疏松性骨折中的研究，目前文獻報道尚少。

因此本研究擬通過建立骨質疏松性骨折大鼠模型，在PTH(1-34)的干預下，檢測骨折斷端標本HE染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色及COL1A1 mRNA表達水平，并與對照組對比，進而探討骨折愈合過程中PTH影響下Ⅰ型膠原代謝的變化。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠骨質疏松模型

選取清潔級SD雌性成年大鼠，體重(300±50)g，分為手術組(OVX組)及假手術組(Sham組)，OVX組大鼠切除雙側卵巢，Sham組僅做背部切口，不切除卵巢。術后3個月，取手術組及假手術組各5只，測定骨密度，觀察模型是否建立成功。

1.2 建立大鼠脛骨骨折內固定模型

OVX組大鼠骨質疏松模型建立成功后，于脛骨中上段1/3處鋸斷雙側脛骨，并以克氏針行脛骨髓腔髓內固定。即建立大鼠脛骨骨折內固定模型。術后于手術切口及克氏針針眼處涂抹紅霉素藥膏，并肌注頭孢呋辛(30 mg/100 g)預防感染。

1.3 分組與取材

將64只骨質疏松脛骨骨折模型大鼠隨機分為兩組，每組32只。A組(PTH組)予以特立帕肽3 μg/(100 g·d)皮下注射，每天一次；B組(NS組)予以等量生理鹽水皮下注射，每天一次。自第一天給藥起，分別于第1、2、4、8 周隨機選取A組及B組大鼠各8只進行取材。處死大鼠后，取雙側脛骨標本，拔除內固定物，一部分脛骨存放于液氮，用RT-PCR檢測COLIA1mRNA的表達水平；另一部分固定于4%多聚甲醛，行HE染色及免疫組化染色。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 骨質疏松模型的建立

大鼠雙側卵巢切除術后3個月，取OVX手術組大鼠及Sham假手術組大鼠各5只，在雙能X線吸收儀上測定其脛骨中上份骨密度。OVX大鼠骨密度：(0.2512±0.0316) g/cm2，Sham組大鼠骨密度：(0.3438±0.0296) g/cm2。OVX大鼠骨密度比Sham組大鼠骨密度降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.99，P<0.05)，骨質疏松模型建立成功。

2.2 骨折模型建立及藥物干預后的指標檢測

2.2.1大鼠脛骨骨折斷端組織COLIA1mRNA合成量：計算COLIA1基因與管家基因相比的相對表達量發(fā)現(xiàn)，在PTH大鼠的脛骨標本中，COL1A1 mRNA的表達有著明顯的升高，差異與NS組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，在第8周時仍沒有衰減的征象。各組大鼠的COL1A1 mRNA合成對比見表1，時間趨勢見圖1。

2.2.2大鼠脛骨骨折斷端HE染色及Ⅰ型膠原免疫組化染色：骨折術后第2周，HE染色可見：PTH組大鼠骨折斷端已趨向閉合，骨折線處有相對于NS組大鼠更多的軟骨細胞；NS組大鼠骨折斷端之間尚有殘存的裂隙，纖維骨痂部分斷裂。Ⅰ型膠原免疫組化可見：PTH組大鼠骨折線軟骨層的邊緣已部分骨化，軟骨層中心可見部分新生的Ⅰ型膠原纖維；而NS組大鼠骨痂組織中未看到新生Ⅰ型膠原的表達。術后第4周HE染色：PTH組大鼠骨痂內軟骨細胞數(shù)量相對較多，骨折線兩側的骨微結構排列一致有序；NS組大鼠骨痂形態(tài)欠佳，軟骨細胞少，骨折線兩側骨微結構紊亂、不對稱。Ⅰ型膠原免疫組化：PTH組大鼠骨痂中有大量Ⅰ型膠原纖維形成，膠原纖維的排列方向均勻一致，呈現(xiàn)出自骨痂中線向骨痂邊緣的對稱性增強；NS組大鼠的骨痂組織中幾乎看不到Ⅰ型膠原的染色。到第8周，兩組大鼠的骨折斷端都已經(jīng)閉合，PTH組大鼠骨痂已基本完全骨化，殘存的軟骨細胞極少，已經(jīng)觀察不到成束的Ⅰ型膠原纖維，僅見大片已修復良好的骨基質；而NS組大鼠骨痂內尚殘存部分未骨化的軟骨細胞， 骨折線兩側還能觀察到血管翳的長入(圖2～4)。

表1 兩組大鼠不同時間點COL1A1 mRNA的相對表達量Table 1 The relative expression levels of COL1A1 mRNA in the two groups of rats at different time points

圖2 骨折術后2 w PTH組與NS組大鼠脛骨骨折斷端切片。A：PTH組大鼠HE染色；B：NS組大鼠HE染色；C：PTH組大鼠Ⅰ型膠原免疫組化；D：NS組大鼠Ⅰ型膠原免疫組化Fig.2 The tibial slices of the PTH group and the NS group of rats 2 weeks after fracture surgery. A: HE staining of the PTH group of rats; B: HE staining of the NS group of rats; C: IHC staining of the PTH group of rats; D: IHC staining of the NS group of rats.

圖1 兩組大鼠COL1A1 mRNA相對表達量隨時間變化趨勢圖Fig.1 The relative expression levels of COL1A1 mRNA in the two groups of rats at different time points

圖3 骨折術后4 w PTH組與NS組大鼠脛骨骨折斷端切片。A：PTH組大鼠HE染色；B：NS組大鼠HE染色；C：PTH組大鼠Ⅰ型膠原免疫組化；D：NS組大鼠Ⅰ型膠原免疫組化Fig.3 The tibial slices of the PTH group and the NS group of rats 4 weeks after fracture surgery. A: HE staining of the PTH group of rats; B: HE staining of the NS group of rats; C: IHC staining of the PTH group of rats; D: IHC staining of the NS group of rats.

3 討論

甲狀旁腺素的基本功能是維持血鈣的平衡，促進磷酸鹽及維生素D3的重吸收，以及調節(jié)骨的代謝[1-2，8]。已有研究證實，PTH對骨代謝的調節(jié)為雙向作用，長期大量的分泌將導致骨的過分吸收與破壞，但是間斷規(guī)律地給予PTH，反而可以增加新骨的生成[13-14]。這種研究是通過檢測骨代謝標記物Ⅰ型前膠原氨基末端前肽(procollagenⅠN-terminal peptide，PINP)、Ⅰ型膠原羧基末端肽(typeⅠcollagen carboxyl terminal peptide，CTX-Ⅰ)等進行的。這些標記物恰是Ⅰ型膠原代謝的產(chǎn)物，這在側面也反映了Ⅰ型膠原的代謝與骨代謝密不可分。正如前文所述，Ⅰ型膠原的含量和排列結構共同影響著骨基質的質量，以及骨的強度。另外有研究報道，在股骨頸骨折患者的骨折部作骨結構的觀察，發(fā)現(xiàn)其板層骨的厚度發(fā)生了變化，提示在骨折處發(fā)生了Ⅰ型膠原排列的紊亂[15]。這表明在骨折斷端，Ⅰ型膠原的排列會產(chǎn)生一定的影響。那么，在應用了PTH之后，Ⅰ型膠原的排列是否會得到有效的改善呢？目前尚沒有相關文獻報道。而編碼Ⅰ型膠原α1鏈的基因正是COL1A1基因，通過對COL1A1 mRNA轉錄水平的檢測，可以推測Ⅰ型膠原代謝的動態(tài)過程，并判斷Ⅰ型膠原含量的變化趨勢。綜上，筆者設計了此實驗，通過PTH干預脛骨骨質疏松性骨折的大鼠，觀察并檢測骨折斷端Ⅰ型膠原的表達及排列，以及COL1A1 mRNA轉錄水平，從而分析PTH對骨質疏松性骨折過程中Ⅰ型膠原代謝的影響。

通過對骨折斷端的染色觀察發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，PTH影響下的Ⅰ型膠原不僅表達更快、更多，其排列結構也更為有序。此前也曾有人進行過類似的研究。Ascenzi等[16]曾對接受PTH治療的骨質疏松女性的皮質骨進行了高倍率的光學及電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在PTH組患者的骨組織中，Ⅰ型膠原排列更為有序、方向更為一致，由此促成了更厚的皮質骨板層。這與本研究觀察的結果是相符合的。不過Ascenzi等并沒有對Ⅰ型膠原的含量進行測定。Saito等[17]則在實驗動物體內進行了PTH注射下膠原蛋白的含量測定。他們以切除卵巢的猴子作為骨質疏松模型，分別進行低劑量(1.2 μg/kg)和高劑量(6.0 μg/kg)hPTH(1-34)每周一次的注射，18個月后監(jiān)測其腰椎椎體的膠原含量。結果發(fā)現(xiàn)在低劑量PTH組中，腰椎椎體內膠原含量明顯高于對照組。然而Saito等的實驗也存在一定的局限性。首先，他們所測定的“膠原”不能明確是單純的Ⅰ型膠原，而很有可能是多亞型膠原的混合；其次，他們的監(jiān)測時間點只有一處，不能很好地反映膠原代謝的動態(tài)變化。Kakar等[18]曾對建立了股骨骨折模型的雄性小鼠進行了為期14 d的PTH(1-34)間斷注射，發(fā)現(xiàn)在細胞外基質中，與軟骨生成和骨生成相關的基因表達升高了3倍，這提示PTH可以促進骨折愈合過程中軟骨的增殖和分化。本研究的HE染色和免疫組化染色結果也印證了Kakar等的推斷，提示PTH能夠有效地加強骨折愈合過程中軟骨內成骨的作用。

本研究還采用了熒光定量PCR的方法，檢測了骨痂附近骨組織內COL1A1 mRNA的相對含量。在前人的研究中，直接研究PTH對大鼠COL1A1基因表達影響的實驗很少見。McClelland 等[19]對雄性大鼠進行了持續(xù)5 d、每天一次(40 ug/kg)的hPTH(1-34)注射，然后對其股骨遠端干骺端的骨組織進行DDRT-PCR擴增，在其中檢測到了COL1A1 mRNA的表達。該實驗對于探索PTH與COL1A1關系具有很好的指導意義，但是也存在不足。首先他們沒有和對照組進行表達量的對比；其次實驗大鼠不是骨質疏松模型，不能排除其基線水平的差異；再次，由于干預時間過短，不能體現(xiàn)COL1A1水平的變化趨勢。本研究借鑒McClelland 等人的經(jīng)驗和教訓，將大鼠隨機分組，在給藥之前檢測了COL1A1的基線表達水平，并將研究時間增加至8 w。最終通過COL1A1表達時間趨勢圖發(fā)現(xiàn)PTH組大鼠的COL1A1基因mRNA轉錄水平有著明顯的升高，這印證了McClelland 等人的研究結果，也側面反映了Ⅰ型膠原的表達是活躍的。

綜上所述，本研究通過觀測PTH干預下骨質疏松骨折大鼠的愈合，證實了PTH可以加強骨折斷端Ⅰ型膠原的代謝，促進Ⅰ型膠原的合成和重塑，從而有效增加骨痂組織Ⅰ型膠原的含量和結構排列。這提示了PTH可以通過調節(jié)Ⅰ型膠原的代謝增加骨的強度，從而有效地治療骨質疏松。