費 鵬趙勝娟姜亦超江 巖劉麗莉肖 楓張慧蕓唐浩國康懷彬

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 長白山食品藥品檢驗檢測中心，吉林 白山 134500；3. 穆棱市食品檢驗檢測中心，黑龍江 牡丹江 157500 )

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)是常見的食源性致病菌之一，主要存在于家畜家禽等動物體內，其中雞是最易攜帶該致病菌的動物[1-3]。中國是雞肉的消費大國，食用未煮熟的雞肉是感染空腸彎曲桿菌的主要原因，感染該致病菌會導致患者腹瀉、關節(jié)炎和格林-巴利綜合征等疾病，嚴重地危害了消費者的健康[4-5]?？漳c彎曲桿菌具有高度的遺傳多樣性，且對抗生素有較強的耐藥性，給充分認識和有效控制該致病菌帶來了難題[6-7]。

對空腸彎曲桿菌遺傳多樣性的研究有助于揭示特定環(huán)境中該致病菌的種群特征，增加對空腸彎曲桿菌的認識，該方向的研究已被研究者們關注[8-10]。陳荀等[11]利用脈沖場電泳技術對雞肉產業(yè)鏈中(糞便、屠宰場中雞肉)的空腸彎曲桿菌進行了分型研究，結果表明，83株供試菌株被分為了45個不同的分子型，揭示了雞肉產業(yè)鏈中該致病菌的分子特征。脈沖場電泳技術的結果并不能揭示基因層面的信息，其結果也不能實現實驗室之間的數據共享，而多位點序列分型(Multilocus Sequence typing，MLST)技術能夠彌補上述不足[12]。Ma等[6]利用MLST技術對天津地區(qū)市售雞肉中的空腸彎曲桿菌進行了分析，研究發(fā)現42株空腸彎曲桿菌被分成了22個不同的序列型(Sequence Type，ST)，并分析了不同STs空腸彎曲桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關系。洪捷等[13]則利用MLST技術研究了分離自江蘇地區(qū)空腸彎曲桿菌的種群特征，31株空腸彎曲桿菌被分成了21個STs。上述報道一定程度上揭示了禽肉及雞肉產業(yè)鏈中空腸彎曲桿菌的遺傳多樣性，然而關于東北地區(qū)市售雞肉中的空腸彎曲桿菌種群特征的研究尚未見報道。

目前，使用抗生素是治療空腸彎曲桿菌感染最有效和常用的方法。然而，隨著抗生素的濫用和長時間的使用，菌株很有可能產生耐藥性。黃金林等[14]發(fā)現奶牛源的空腸彎曲桿菌具有多重耐藥性。周倩等[15]分析了禽源的空腸彎曲桿菌的耐藥性，發(fā)現了一株對92.6%的抗生素都具有耐藥性的菌株。Yang等[9]發(fā)現長時間的紅外突變處理能夠顯著地提高空腸彎曲桿菌桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素、強力霉素、氟苯尼考、氯霉素和慶大霉素的耐受性。這些研究表明，對空腸彎曲桿菌進行及時的耐藥性監(jiān)測是非常必要的。

本研究以東北地區(qū)市售雞肉為研究對象，對其空腸彎曲桿菌的污染情況進行調查，利用MLST技術分析其遺傳多樣性，系統(tǒng)地揭示東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的種群特征。在此基礎上，對分離株進行耐藥性監(jiān)測，以期為市售雞肉中空腸彎曲桿菌的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品采集：2017年1月～11月，采集東北地區(qū)市售的雞肉樣品1 000份，其中雞胸肉和雞翅各500份，用無菌棉簽擦拭(3 cm×3 cm)，并保存在磷酸鹽(phosphate buffered saline，PBS)緩沖液中，低溫保存運往實驗室；

溶菌肉湯(Lysogeny Broth, LB)、PBS緩沖液、脫纖維綿羊血、CCDA選擇性培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司；

21種藥敏紙片：北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司；

引物合成：蘇州金唯智生物科技有限公司；

細菌全基因組DNA試劑盒、2×PCR Master Mix：天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器設備

高速臺式離心機：GT10-1型，北京時代北利離心機有限公司；

高壓滅菌鍋：SANYO型，上海迭戈生物科技有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9272A型，常州諾基儀器有限公司；

電泳儀：BIO-RAD型，北京伯樂生命科學發(fā)展有限公司；

生物潔凈工作臺：BCW-1000型，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；

PCR儀：Veriti?型，北京昊諾斯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 空腸彎曲桿菌的分離鑒定 根據周倩等[15]的方法，取100 μL PBS稀釋液，對其進行分離純化。挑取單菌落，接種在5%脫纖維羊血的LB肉湯培養(yǎng)基中，在微需氧(10% CO2，5% O2，85% N2)、37 ℃的條件下培養(yǎng)48 h。吸取空腸彎曲桿菌菌液2 mL，根據細菌全基因組DNA試劑盒說明書對其進行DNA提取，利用16S rRNA 測序技術進行鑒定。

1.3.2 看家基因PCR擴增及測序 按照Lévesque等[16]的報道合成引物(aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA)，以空腸彎曲桿菌 DNA 為模板，對其進行PCR擴增。擴增體系(50 μL)為：DNA模板2 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，雙蒸水23 μL。7對引物的反應體系相同，均為：94 ℃預變性10 min，30個循環(huán)(94 ℃，1 min；50 ℃，1 min；72 ℃，1 min)，最后72 ℃延伸10 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行驗證，并對PCR產物進行基因測序分析。

1.3.3 空腸彎曲桿菌MLST分析 登陸空腸彎曲桿菌MLST數據庫(http://pubmlst.org/campylobacter/)，將看家基因的基因測序結果在數據庫中進行比對，得到7個看家基因的等位基因號，并根據7個等位基因號確定空腸彎曲桿菌的序列型(Sequence Type，ST)，并利用MEGA6.0軟件對串序列進行最小似然系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.4 空腸彎曲桿菌的耐藥性分析 選取8種抗生素，利用美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)推薦的K-B瓊脂擴散法，分析空腸彎曲桿菌的耐藥性。將活化的菌液稀釋至0.5麥氏濃度，然后根據藥敏紙片說明書進行測試，在微需氧、37 ℃ 的條件下培養(yǎng)48 h，根據抑菌圈直徑的大小(mm)按CLSI/NCCLS評估空腸彎曲桿菌的耐藥性。

2 結果與分析

2.1 東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況

東北地區(qū)1 000份市售雞肉中共有62份空腸彎曲桿菌陽性樣品，總污染率為6.2%，具體見表1。62份陽性樣品中雞胸肉樣品37份(7.4%)，雞翅樣品25份(5.0%)，可見雞胸肉中空腸彎曲桿菌的污染率高于雞翅。東北5個不同地區(qū)市售雞肉空腸彎曲菌的污染率分別為5.5%(A)、5.5%(B)、7.5%(C)、6.0%(D)、6.5%(E)。在2012年和2013年的調查中發(fā)現雞肉中空腸彎曲桿菌的污染分別為11.5%[17]和1..66%[18]，本研究中東北地區(qū)市售雞肉中該致病菌的污染率為6.2%，明顯低于之前的污染率。

表1 東北地區(qū)市售雞肉空腸彎曲桿菌污染情況?

Table 1 The contamination ofC.jejuniin commercial chicken in Northeast China

%

? 樣品數為100。

2.2 東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的MLST分析

將62株空腸彎曲桿菌看家基因的序列在數據庫中進行比對，得到看家基因等位基因號和ST，結果見表2。62株空腸彎曲桿菌被分為了14個ST，分別為ST1(15株)、ST5(24株)、ST28(2株)、ST52(4株)、ST64(4株)、ST88(3株)、ST90(1株)、ST236(1株)、ST456(2株)、ST751(1株)、ST905(1株)、ST1222(2株)、ST3228(1株)和ST3242(1株)，說明該致病菌具有較高的遺傳多樣性。其中ST5和ST1型的空腸彎曲桿菌分別占總菌株數的31.87% 和24.19%，是雞肉中空腸彎曲桿菌的優(yōu)勢ST。在董俊等[19]的研究中顯示分離自湖北地區(qū)禽類的空腸彎曲桿菌的優(yōu)勢ST353和ST464。這些與本研究的結果并不一致，是因為空腸彎曲桿菌的分離地區(qū)和來源不同，說明不同地區(qū)和來源的空腸彎曲桿菌在種群組成上存在差異。

表2 62株空腸彎曲桿菌MLST分析結果

2.3 不同ST空腸彎曲桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

以不同ST的空腸彎曲桿菌看家基因串聯序列為研究對象，利用MEGA6.0軟件構建最小似然算法系統(tǒng)發(fā)育樹，得到了清晰的系統(tǒng)發(fā)育關系，結果見圖1。在14個不同的ST中，ST90和ST456，ST88和ST1222之間具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關系，說明上述2組ST的菌株可能具有相近的生物學特性和侵染特性。ST3242明顯遠離了其他13個ST，說明ST324的空腸彎曲桿菌與其他菌株親緣上有一定的距離，因此該菌株應該進行進一步的研究，確定其是否有獨特的侵染和致病能力。

圖1 不同ST空腸彎曲桿菌7個看家基因串聯序列最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 1 Maximum-likelihood tree of splicing sequence of 7 housekeeping genes inC.jejuniwith different STs

2.4 空腸彎曲桿菌耐藥性分析

62株空腸彎曲桿菌對8種抗生素的耐藥性分析結果見表3，在8種抗生素中對環(huán)丙沙星和復方新諾明的耐受率為0%，對其他6種抗生素的耐受率分別為91.94%(紅霉素),88.71%(慶大霉素),74.19%(克林霉素),38.71%(青霉素),25.81%(四環(huán)素),6.45%(頭孢噻肟)。這些結果表明空腸彎曲桿菌對大多數的抗生素都產生了耐藥性，而所有的受試菌株都不耐受環(huán)丙沙星和復方新諾明，因此可以利用這2種抗生素預防和治療空腸彎曲桿菌的感染。

表3 62株空腸彎曲桿菌耐藥性分析

3 結論

本研究調查了東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況，其污染率為6.2%。62株空腸彎曲桿菌被分為了14個ST，分別為ST1、ST5、ST28、ST52、ST64、ST88、ST90、ST236、ST456、ST751、ST905、ST1222、ST3228和ST3242，其中ST5和ST1為優(yōu)勢的STs，說明空腸彎曲桿菌具有豐富的遺傳多樣性?？股啬退幮苑治霰砻骺漳c彎曲桿菌對環(huán)丙沙星、復方新諾明和頭孢噻肟具有高度的敏感性，而對紅霉素、慶大霉素、克林霉素、青霉素和四環(huán)素的耐受性較強。本研究的結果有助于了解東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況、種群特征和抗生素耐藥性，為了進一步揭示環(huán)境對空腸彎曲桿菌種群特征的影響，接下來的研究將用更為先進的全基因組測序技術分析空腸彎曲桿菌的遺傳進化特性，并挖掘與耐藥性相關的功能基因。