李紀(jì)順, 陳 凱, 李 玲, 趙忠娟, 楊玉忠, 楊合同

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東省科學(xué)院生態(tài)研究所, 山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 濟(jì)南 250103)

番茄猝倒病(tomato damping-off)是番茄苗期重要的毀滅性病害,多發(fā)生在苗床前期,感病幼苗易倒伏死亡,造成約60%的減產(chǎn)[1-2]。病原菌為卵菌門鞭毛菌亞門中的腐霉屬Pythiumspp.低等真菌,常以卵孢子生存繁殖,可在土中、水中腐生或寄生存活較長一段時(shí)間[3-4]。防治番茄猝倒病的主要方法是采用化學(xué)殺菌劑,但由于過量和不合理使用化學(xué)農(nóng)藥防治病害帶來的一系列健康和環(huán)境問題,安全的生物防治越來越受到重視和應(yīng)用[5-7]。

目前防治番茄猝倒病的生防菌種類主要包括芽胞桿菌和木霉[8-10],木霉因生長速度快、產(chǎn)孢能力強(qiáng)、分布廣泛、并具有細(xì)胞壁降解酶活性和代謝產(chǎn)生大量的抗生性物質(zhì)而得到廣泛關(guān)注,但由于自然來源的木霉菌株田間應(yīng)用效果不夠理想,制約了其進(jìn)一步推廣應(yīng)用[11-13]。利用現(xiàn)代生物技術(shù)對菌株進(jìn)行改良選育,是獲得高效多功能生防菌株的有效手段[14-15]。本實(shí)驗(yàn)室前期利用原生質(zhì)體融合技術(shù),選育得到1株木霉融合子Tpf-2,該融合子綜合生防性狀較好,溫室條件下對番茄猝倒病的防治效果達(dá)到85.0%以上,并可產(chǎn)生豐富的厚垣孢子[16]。厚垣孢子是木霉在逆境下產(chǎn)生的一種繁殖體,該類孢子在儲存、萌發(fā)及在逆境下的存活能力均遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于分生孢子,田間應(yīng)用時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性[17],故以木霉融合子Tpf-2的厚垣孢子為有效成分制備微生物制劑進(jìn)行病害防治,具有較好的應(yīng)用前景。

木霉與植物的互作是一個(gè)復(fù)雜的過程,生防菌能否在靶標(biāo)植物體內(nèi)及其根際適應(yīng)并定殖存活是篩選、評價(jià)土傳病害生防菌的重要指標(biāo)[18],植物體內(nèi)參與生理代謝過程多種防御反應(yīng)酶與植物抵抗病原菌入侵也有密切關(guān)系[19-20]。本文以前期生防效果較好的木霉融合子Tpf-2為試驗(yàn)菌株,重點(diǎn)研究接種病原菌瓜果腐霉P.aphanidermatum后,融合子Tpf-2在番茄根際土中的定殖動(dòng)態(tài),及對番茄葉片中相關(guān)防御酶的誘導(dǎo)活性,旨在探索供試菌株對番茄猝倒病的生防潛力及其與番茄植株誘導(dǎo)抗性的關(guān)系,進(jìn)而為抗番茄猝倒病生防真菌的篩選及生防機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù),為制劑改進(jìn)和防效評價(jià)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

供試菌株為木霉融合子Tpf-2,生防制劑為其厚垣孢子可濕性粉劑,有效成分含量為2億/g。病原真菌為瓜果腐霉P.aphanidermatumAcu36125,購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心,病原真菌在PDA平板上培養(yǎng)后,用無菌打孔器打取直徑5 mm的菌塊備用。番茄品種為日本‘京寶’,購自濟(jì)南大江種子有限公司。

1.2 試劑與儀器

Powersoil DNA Isolation Kit試劑盒,MoBio公司;Roche Light Cycler96熒光定量儀,羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;TransStart Top Green qPCR SuperMix,Trans15K DNA Marker,北京全式金有限公司;DL2000 DNA Marker,TaKaRa公司;普析TU-1810紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司。

1.3 溫室試驗(yàn)

溫室試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理:清水對照(CK)、瓜果腐霉P.aphanidermatum(Pa)、木霉融合子Tpf-2(Tpf-2)、木霉融合子Tpf-2+瓜果腐霉P.aphanidermatum(Tpf-2+Pa)。

試驗(yàn)用土為大田健康土,番茄種子于25℃催芽至露白。播種時(shí),CK處理組每盆放置10粒種子;Pa處理組每盆接入2塊瓜果腐霉菌塊,并放置10粒種子;Tpf-2處理組每盆放置10粒種子,種子上均勻撒入55 mg的Tpf-2制劑;Tpf-2+Pa處理組每盆接入2塊瓜果腐霉菌塊,并放置10粒種子,種子上均勻撒入55 mg的Tpf-2制劑。每個(gè)處理組種植21盆。

在人工氣候室內(nèi)于光暗周期為10 h∥14 h,晝夜溫度為25℃∥18℃,空氣相對濕度為50%～70%的條件下,對盆栽樣品進(jìn)行管理,各處理和對照分別于播種后15、30、45、60、90、120、150 d取樣檢測Tpf-2在番茄根際土中的定殖動(dòng)態(tài),并于播種后60 d取樣檢測番茄葉片相關(guān)防御酶活性,每次取樣設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 木霉融合子Tpf-2在番茄根際土中的定殖動(dòng)態(tài)檢測

取樣時(shí),將番茄根部小心地拔出,抖掉表層土,收集根際土,放入自封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,土壤微生物基因組總DNA采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒進(jìn)行提取,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

前期試驗(yàn)表明,木霉融合子Tpf-2的Tef1區(qū)與已知木霉種類的Tef1區(qū)差異較大,同源性低于95.0%,本文以Tpf-2的Tef1區(qū)設(shè)計(jì)特異基因片段引物,Tef1F:5′-GTTTTCGTCACCCCGCTTCC-3′,Tef1R: 5′-GTGGCAGAGCAGGGCAAAAGA-3′,以微管蛋白β-tubulin基因?yàn)閮?nèi)參,基因片段引物為TubF:5′-GAAGATGTCGTCCACCTTTATT-3′,TubR:5′-GTGAACTCCATCTCGTCCAT-3′。以不同土壤DNA樣品為模板,首先利用常規(guī)PCR檢測引物的特異性,并通過qPCR檢測木霉融合子Tpf-2的定殖動(dòng)態(tài),每個(gè)樣品重復(fù)3次。

qPCR采用20 μL反應(yīng)體系:2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL,10 μmol/L引物各0.4 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 8.2 μL。qPCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性5 s,60℃退火15 s,72℃延伸10 s,40個(gè)循環(huán);按0.1℃/s升溫速率從65℃升至95℃,每升高0.5℃檢測1次熒光信號,進(jìn)行熔解曲線分析。以木霉融合子Tpf-2處理組播種后150 d取樣樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣品,利用2-ΔΔCt計(jì)算樣品中目的基因的相對定量結(jié)果[21],其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,ΔΔCt=ΔCt試驗(yàn)樣品-ΔCt標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.5 木霉融合子Tpf-2誘導(dǎo)番茄葉片防御酶活性檢測

番茄幼苗期是番茄發(fā)育的重要時(shí)期,這一階段子葉和真葉生長得好壞直接影響番茄進(jìn)一步的生長發(fā)育,本試驗(yàn)選取種植60 d的番茄葉片進(jìn)行防御酶活性檢測,主要檢測超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD及過氧化氫酶CAT活性的變化[22-24],每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

酶活性計(jì)算:SOD活性單位以抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原50%所需酶量為1個(gè)酶活單位(U),SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(U·g-1);POD以每分鐘吸光度變化值(ΔA470)表示酶活力的大小(U·g-1·min-1);CAT以每分鐘吸光度變化值(ΔA240)表示酶活性大小(U·g-1·min-1)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的鄧肯氏(Duncan’ s)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,以不同大寫字母表示在0.01水平上存在極顯著性差異,以不同小寫字母表示在0.05水平上存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉融合子Tpf-2的定殖動(dòng)態(tài)檢測

2.1.1 土樣DNA提取與檢測

利用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取土樣中的DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶,結(jié)果見圖1,不同處理,不同取樣時(shí)間采集的各土樣中均可提取到微生物總DNA。

圖1 土樣DNA電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram of soil DNA

2.1.2 引物特異性檢測

用設(shè)計(jì)的目的基因引物Tef1F/Tef1R及內(nèi)參基因引物TubF/TubR對第一次取樣(15 d)的土樣DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果見圖2。用內(nèi)參基因引物TubF/TubR擴(kuò)增時(shí),4個(gè)處理中均擴(kuò)增出大小144 bp的條帶,說明所有土樣中均有真菌DNA的存在。用目的基因引物Tef1F/Tef1R擴(kuò)增時(shí),CK和Pa中未擴(kuò)增到條帶,而Tpf-2和Tpf-2+Pa則擴(kuò)增出大小159 bp的目的條帶,說明設(shè)計(jì)的目的基因引物具有特異性和高度準(zhǔn)確性,可以利用該引物進(jìn)行后續(xù)的定量分析檢測。

2.1.3 木霉融合子Tpf-2的定殖動(dòng)態(tài)

利用熒光定量qPCR檢測木霉融合子Tpf-2厚垣孢子在番茄根際土中的定殖動(dòng)態(tài),結(jié)果見圖3。整個(gè)番茄生育周期內(nèi)(0～150 d),Tpf-2和Tpf-2+Pa處理組中均檢測到木霉融合子Tpf-2的定殖,說明木霉融合子Tpf-2的厚垣孢子可在番茄根際土中長期存活。兩種處理下,木霉融合子Tpf-2的相對定殖數(shù)量隨時(shí)間的延長呈下降趨勢,并且在同一取樣時(shí)間點(diǎn)上,Tpf-2+Pa處理組中木霉融合子Tpf-2的定殖數(shù)量高于Tpf-2處理組的定殖數(shù)量,說明瓜果腐霉刺激了木霉融合子Tpf-2的定殖。

圖2 目的基因引物與內(nèi)參基因引物對不同處理 土樣DNA的PCR擴(kuò)增圖譜Fig.2 Amplification of DNA from different treatments by specific primers Tef1F/Tef1R or internal reference primers TubF/TubR

圖3 木霉融合子Tpf-2在番茄根際土中的qPCR結(jié)果Fig.3 qPCR analysis of Trichoderma fusant Tpf-2 colonization in tomato rhizosphere soils

2.2 木霉融合子Tpf-2誘導(dǎo)番茄葉片防御酶活性結(jié)果

番茄幼苗期(60 d)葉片中3種防御酶SOD、POD及CAT在不同處理下的活性變化如圖4所示。

與對照CK相比,其他3組處理均能提高番茄葉片中SOD、POD及CAT的活性,但Pa處理組與CK在0.05水平上無顯著性差異,說明瓜果腐霉P.aphanidermatum對3種防御酶的活性影響不大。

Tpf-2及Tpf-2+Pa處理組與CK及Pa處理組間存在極顯著性差異(P<0.01),說明木霉融合子Tpf-2可顯著提高番茄葉片中SOD、POD及CAT的活性。

4組處理中,Tpf-2+Pa處理組的SOD、POD及CAT酶活性影響效應(yīng)最大,對SOD的誘導(dǎo)效果與Tpf-2處理組間存在顯著性差異(P<0.05),說明病原真菌P.aphanidermatum的存在,可顯著提高木霉融合子Tpf-2對番茄葉片SOD酶的誘導(dǎo)效果;對POD和CAT的誘導(dǎo)效果,Tpf-2與Tpf-2+Pa處理組間存在極顯著性差異(P<0.01),說明在瓜果腐霉P.aphanidermatum存在的情況下,木霉融合子Tpf-2可極顯著誘導(dǎo)番茄葉片POD和CAT活性的提高。

圖4 木霉融合子Tpf-2誘導(dǎo)對番茄葉片防御酶活性的影響Fig.4 Defense enzyme activities of tomato leaf after inoculated with Trichoderma fusant Tpf-2

3 討論

能否在植物上成功定殖是評價(jià)生防菌的一個(gè)重要指標(biāo),傳統(tǒng)方法是對其進(jìn)行平板稀釋計(jì)數(shù),但是此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)工,并且靈敏度不高。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)技術(shù)因其操作簡單,特異性高等優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用到環(huán)境中不同木霉菌的檢測[25-26]。

本試驗(yàn)用到的生防菌株為木霉融合子Tpf-2,經(jīng)序列分析表明,該融合子的Tef1區(qū)與已知木霉其他種類的Tef1區(qū)序列差別較大,故以此設(shè)計(jì)特異引物對目的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和定量分析,排除了土壤中其他木霉及其他真菌的干擾,保證了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

相對定量結(jié)果表明:木霉融合子Tpf-2厚垣孢子可在番茄根際土中長期定殖,定殖周期不低于150 d,較以前報(bào)道的分生孢子的定殖時(shí)間不超過100 d[27]大幅延長。Tpf-2和病原菌聯(lián)合處理后,Tpf-2定殖數(shù)量較不加病原菌的處理組呈增加趨勢,說明病原菌可刺激Tpf-2的定殖量,為病害防治奠定了基礎(chǔ)。前人報(bào)道指出,棘孢木霉T.asperellum在黃瓜根際的數(shù)量經(jīng)歷了低-高-低的動(dòng)態(tài)變化,棘孢木霉施入土壤后有一個(gè)適應(yīng)過程,一旦適應(yīng)后,其定殖數(shù)量能夠迅速上升[28]。本試驗(yàn)中Tpf-2厚垣孢子相對定殖數(shù)量隨時(shí)間的延長呈降低趨勢,說明Tpf-2厚垣孢子在番茄根際土中并沒有產(chǎn)生明顯的繁殖現(xiàn)象,本結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道的有所不同,具體原因有待進(jìn)一步探討。

木霉是一類能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的生物因子,誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生一系列局部或系統(tǒng)防御反應(yīng)。防御反應(yīng)與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等的活性提高關(guān)系密切[29-31]。木霉融合子Tpf-2可顯著提高番茄葉片中SOD、POD及CAT的活性,在瓜果腐霉存在的情況下其誘導(dǎo)效果更顯著,說明木霉在番茄遭受病原菌入侵后,能夠?qū)Ψ阎信c抗病相關(guān)的3種酶CAT、SOD及POD活性的提高起到一定的誘導(dǎo)作用,從而間接使得植物體獲得抗病作用。

綜上所述,木霉融合子Tpf-2能夠成功定殖在番茄根際,并且能有效誘導(dǎo)植物內(nèi)在的生防反應(yīng)物質(zhì),提高植物的抗病性。該研究為新的生防菌劑的開發(fā)研究奠定了一定的基礎(chǔ),有助于新型菌劑的開發(fā)利用。