徐秀蘭, 蘆 鈺, 趙子婧, 吳 萍, 宋順華, 宮國(guó)義, 張海軍

(1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心, 農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100097; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 北京 100193)

瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病(bacterial fruit blotch,也稱果腐病)是由西瓜嗜酸菌Acidovoraxcitrulli(曾命名Pseudomonaspseudoalcaligenessubsp.citrulli;Acidovoraxavenaesubsp.citrulli)引起的,可造成西甜瓜減產(chǎn)甚至絕收的毀滅性病害[1-2]。病原菌A.citrulli還可侵染哈密瓜、南瓜、西葫蘆、絲瓜、苦瓜、黃瓜等多種葫蘆科作物[3-4]。自20世紀(jì)90年代細(xì)菌性果斑病在美國(guó)的西瓜種植田大暴發(fā)以來(lái),近20年該病在全球多個(gè)國(guó)家迅速傳播。瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病傳播迅速,主要與A.citrulli通過(guò)種子傳帶(seed transmission)和日益頻繁的國(guó)際種子貿(mào)易相關(guān)[5]。目前果斑病在我國(guó)北京、山東、新疆、東北、江蘇、海南等多個(gè)省市及地區(qū)均有危害,不僅給我國(guó)的西甜瓜生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失,也對(duì)西甜瓜制種業(yè)帶來(lái)了很大沖擊[6]。

A.citrulli可附著在種子表面,并可長(zhǎng)期存活于種皮下外胚乳層。制種田田間病害監(jiān)控、種子檢測(cè)、種子處理是病害防控的首要環(huán)節(jié)。我國(guó)西瓜種子采收過(guò)程中,往往采用發(fā)酵方法脫去種子上連帶的果膠,然而發(fā)酵過(guò)程對(duì)西瓜嗜酸菌的種子感染是否有影響還未見(jiàn)研究報(bào)道。本文主要通過(guò)控制不同的發(fā)酵時(shí)間和溫度,研究果斑病菌在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)西瓜種子的感染情況,揭示發(fā)酵時(shí)間和溫度條件對(duì)種子帶菌的影響,從而指導(dǎo)病害防控。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)

菌株:Acidovoraxcitrulli(編號(hào):Xu 3-14)分離自北京順義西瓜發(fā)病幼苗,REP-PCR分型為I型。菌株懸浮于15%甘油,保存在-80℃冰箱中。菌株活化培養(yǎng)采用PF培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L,瓊脂15 g/L,甘油10 mL/L,1 mol/L 磷酸氫二鉀14 mL/L,1 mol/L 硫酸鎂 24 mL/L),于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。

1.2 西瓜種子發(fā)酵與接種

從制種田挑取健康成熟西瓜果實(shí)(品種:‘京欣’),果皮清洗消毒后,縱切,掏取種子,放入滅菌的燒杯。每個(gè)燒杯放入300 粒種子,100 mL西瓜汁。用搖培24 h的A.citrulliXu 3-14配制菌液,每個(gè)燒杯接種Xu 3-14菌液1 mL,其終濃度為106cfu/mL,對(duì)照為不接菌的發(fā)酵液,設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)溫度分別為20℃和30℃,4個(gè)重復(fù)。燒杯放入搖床以60 r/min低速發(fā)酵培養(yǎng),分別在發(fā)酵12、24、36、48、60 h時(shí)取樣測(cè)量發(fā)酵液pH,并取1 mL發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋,涂布于PF培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng),檢測(cè)A.citrulli菌量。分別在24、48、60 h時(shí)隨機(jī)選取100粒種子,沖洗3次,室溫自然晾干48～72 h,作為種子帶菌檢測(cè)的樣本。

1.3 西瓜種子帶菌檢測(cè)

對(duì)不同發(fā)酵溫度、不同發(fā)酵時(shí)間取出的種子進(jìn)行種子帶菌分析。分別檢測(cè)種子外部和內(nèi)部帶菌量(分為種皮內(nèi)部帶菌率及種仁帶菌率)。種子外部帶菌量的檢測(cè)方法:將待檢種子(50粒/重復(fù),4個(gè)重復(fù))浸入20 mL磷酸鉀緩沖液(80.2 mmol/L K2HPO4, 19.2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)中,使用脈沖振蕩樣品前處理器(HKM shockmixer-1)以93次/s速度振蕩15 s,隨后以28℃,120 r/min條件搖培4 h,取出后再次劇烈振蕩15 s,將浸提液轉(zhuǎn)移到滅菌的50 mL離心管中,8 000 r/min離心10 min,棄上清,將沉淀重新溶于1 mL 滅菌水中,作為原液。對(duì)原液進(jìn)行梯度稀釋,分別吸取10-3、10-4、10-5稀釋液各100 μL,涂板于PF和半選擇性培養(yǎng)基mEBB培養(yǎng)基上[7-8]。28℃培養(yǎng)3～5 d后,根據(jù)菌落形態(tài)挑選疑似菌落進(jìn)行PCR鑒定。種子內(nèi)部帶菌率通過(guò)單粒檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定,共檢測(cè)100粒種子:對(duì)待檢種子進(jìn)行外部消毒(1%次氯酸鈉浸泡5 min后用滅菌蒸餾水沖洗2遍),使用滅菌鑷子將種皮與種仁分離、分別收集到1.5 mL離心管中,加入300 μL磷酸鉀緩沖液，利用旋渦振蕩器充分振蕩15 s后,隨后以28℃,120 r/min條件搖培4 h,取出后再次劇烈振蕩15 s,浸提液直接進(jìn)行涂板及分子檢測(cè)。A.citrulli菌落在PF培養(yǎng)基上很小,呈圓形,淡黃色,菌落表面光滑;在mEBB培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d后形成直徑約為1～2 mm的菌落,呈圓形,培養(yǎng)4～5 d后,菌落繼續(xù)擴(kuò)大并形成橄欖綠色的中心。菌落純化經(jīng)PCR確認(rèn),并計(jì)數(shù)推算種子外部帶菌量及種子內(nèi)部帶菌率。

1.4 西瓜出苗發(fā)病檢測(cè)

對(duì)不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵不同時(shí)間的種子(50粒/重復(fù),4個(gè)重復(fù))進(jìn)行出苗檢測(cè)。以滅菌的細(xì)沙為發(fā)芽基質(zhì),25℃恒溫條件培養(yǎng)3 d后,繼而在25℃培養(yǎng)8 h,20℃培養(yǎng)16 h,保持培養(yǎng)箱濕度>70%。培養(yǎng)第5天起,每天觀察子葉是否有水浸狀病斑出現(xiàn),出現(xiàn)癥狀后記錄發(fā)病數(shù)量,為避免在高濕條件下幼苗之間的病害傳播,及時(shí)將發(fā)病株取出進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)確認(rèn)。

1.5 培養(yǎng)菌落及病株的熒光定量PCR檢測(cè)

將種子帶菌檢測(cè)分離培養(yǎng)到的典型菌落用無(wú)菌水制成108cfu/mL菌液(OD600=0.15),放入-20℃凍融后取1 μL作為反應(yīng)模板。另取發(fā)病苗病健交界部位組織,放入無(wú)菌水中研磨,振蕩,取1 μL作為反應(yīng)模板。以A.citrulliXu 3-14為陽(yáng)性對(duì)照,配制不同濃度梯度菌懸液作為PCR反應(yīng)模板,以Cq值為x軸,熒光值為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。陰性對(duì)照為無(wú)菌水。熒光定量PCR引物和探針序列[9]為BOXAACF: GCG TAT GAG TCC CG AAG AA AT; BOXAACR2: GCA TGC CTT GTA TTC AGC TAT; AAC probe: 6-FAM-CCG AAA TCC GTA TTG GAC GGA TCG AA-BHQ1。擴(kuò)增體系為25 μL,包括:2×Probe Master Mix 12.5 μL;AAC probe (20 μmol/L) 0.30 μL;BOXAACF (20 μmol/L) 0.35 μL;BOXAACR2 (20 μmol/L) 0.35 μL;滅菌H2O 10.5 μL;樣品模板1 μL。反應(yīng)擴(kuò)增條件:95℃ 3 min;95℃ 15 s、60℃ 20 s,40個(gè)循環(huán);40℃ 5 min。反應(yīng)使用Roche羅氏LightCycler?480II儀器進(jìn)行,使用儀器配套軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。判定Cq≤35為陽(yáng)性樣品,Cq>35為陰性樣品。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。數(shù)據(jù)采用SAS 8.1和Minitab 17軟件進(jìn)行方差及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵條件下發(fā)酵液pH與A.citrulli菌量的變化

在西瓜發(fā)酵過(guò)程中,不同溫度條件下(20℃, 30℃),發(fā)酵液的pH變化趨勢(shì)一致。發(fā)酵液初始pH為6.5,發(fā)酵36 h內(nèi)pH迅速降低,而后降低趨于緩慢。然而低溫條件下發(fā)酵液的pH顯著高于高溫條件下的發(fā)酵液。發(fā)酵60 h,發(fā)酵液pH降低到4.0(圖1)。不同溫度條件下,發(fā)酵液中A.citrulli菌量變化則呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì),菌量均在發(fā)酵24 h后達(dá)到峰值1010cfu/mL,24 h后菌量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖2),發(fā)酵60 h菌量降低到106cfu/mL。不接菌的發(fā)酵液中未檢測(cè)出A.citrulli。

2.2 不同發(fā)酵條件下西瓜種子帶菌檢測(cè)結(jié)果

種子外部檢測(cè)結(jié)果表明,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),不同溫度條件下的種子外部帶菌量均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)(表1)。兩個(gè)發(fā)酵溫度下,發(fā)酵24 h的種子外部帶菌量均達(dá)到了108cfu,而發(fā)酵48 h和60 h的種子外部帶菌量均大幅下降,降到了105cfu 左右。然而種子內(nèi)部的病菌感染率只有在30℃發(fā)酵溫度下有顯著增高。20℃發(fā)酵條件下種皮帶菌率維持在10%左右。此外,30℃發(fā)酵條件下,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)種仁帶菌率略有上升,兩個(gè)溫度條件下相比,24 h種仁感染率較為接近,平均為1.35%;而48 h時(shí)30℃下種仁帶菌率顯著增高到5.5%,20℃條件下在60 h也接近5%。根據(jù)梯度涂板稀釋培養(yǎng)菌落數(shù)計(jì)算,內(nèi)部種皮的平均帶菌量為1.2×103cfu/粒,種仁的帶菌量為1.5×103cfu/粒。不接菌發(fā)酵液對(duì)照種子未檢測(cè)出A.citrulli。

圖1 不同發(fā)酵溫度條件下西瓜發(fā)酵液pH的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Kinetic changes in pH values of the watermelon fermentation liquid in 60 hours under different temperatures

圖2 不同發(fā)酵溫度條件下西瓜發(fā)酵液中Acidovorax citrulli菌量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The kinetic changes in the bacterial cell density of Acidovorax citrulli in watermelon fermentation liquid in 60 hours under different temperatures

發(fā)酵時(shí)間/hFermentation time種子外部帶菌量/log10(cfu·mL-1)Bacterial amount on the exterior of seeds20℃30℃內(nèi)部種皮感染率/%Infestation rate in the interior of seed coat20℃30℃種仁感染率/%Embryo infestation rate20℃30℃24(8.6±0.3)a(7.9±0.2)a(10.8±3.6)a(9.6±1.7)b(1.4±0.9)a(1.3±0.8)a48(7.7±0.1)b(6.9±0.7)b(13.2±4.1)a(15.8±0.8)a(1.4±0.9)a(5.5±0.9)a60(4.6±0.3)c(5.0±0.7)c(10.3±1.6)a(13.8±1.8)a(4.8±2.5)a(4.1±2.2)a

1) 同一列中具有相同字母的數(shù)值表示在0.05水平差異不顯著。

Values followed with the same letter listed in the same column indicate no significant difference at 0.05 level.

2.3 不同發(fā)酵條件下西瓜種子的幼苗發(fā)病率

在不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵不同時(shí)間的種子出苗后均有不同程度的發(fā)病(圖3),但發(fā)病率差異不顯著,均在10%左右。20℃條件下,在同等發(fā)酵時(shí)間取出的種子發(fā)病率相較于30℃略低。在30℃條件下,發(fā)酵48 h后,種子發(fā)病率達(dá)到峰值,為11.7%,而在20℃條件下,種子發(fā)病率的最高值發(fā)生在發(fā)酵60 h后,為10.1%。結(jié)果表明西瓜種子發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵液混入微量A.citrulli菌情況下,會(huì)導(dǎo)致西瓜幼苗發(fā)病,發(fā)病率接近10%。雖然20℃條件下發(fā)病率略低,發(fā)酵溫度對(duì)種子出苗發(fā)病率的影響并不顯著。不接菌發(fā)酵液對(duì)照種子幼苗生長(zhǎng)正常,無(wú)發(fā)病。

2.4 發(fā)酵條件與種子內(nèi)外感菌程度的相關(guān)性分析

兩次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致,綜合分析,發(fā)現(xiàn)西瓜種子發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵溫度對(duì)于A.citrulli感染種子沒(méi)有顯著影響,而發(fā)酵時(shí)間對(duì)種子外部帶菌量有顯著影響。發(fā)酵溫度、時(shí)間對(duì)種子內(nèi)部帶菌和出苗發(fā)病率沒(méi)有顯著影響,溫度與時(shí)間的互作也不顯著(表2)。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間、溫度條件下收獲的西瓜種子 出苗發(fā)病率比較Fig.3 Disease incidence of watermelon seedlings germinated from the seed harvested under different fermentation times and temperatures

影響因素FactorP值 P value種子外部帶菌量Bacterial amount on theexterior of seed種皮內(nèi)部帶菌率Infestation rate in theinterior of seed coat種仁帶菌率Embryo infestation rate出苗發(fā)病率Seedling disease incidence發(fā)酵溫度0.233 60.910 00.656 10.393 3發(fā)酵時(shí)間<0.000 1*0.866 70.459 70.670 9發(fā)酵時(shí)間×發(fā)酵溫度0.133 80.840 40.849 50.908 1

1)*表示顯著(P<0.05)。

*indicates significant difference (P<0.05).

對(duì)發(fā)酵液pH、發(fā)酵液菌量、種子外部帶菌量、種子內(nèi)部帶菌率和出苗發(fā)病率各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH、發(fā)酵液中的菌量和種子內(nèi)部帶菌量有顯著相關(guān)性(P<0.05)。其中發(fā)酵液pH與發(fā)酵液菌量的相關(guān)系數(shù)較高(R2=0.843,圖4),回歸曲線顯示發(fā)酵液pH偏低時(shí)(5.0～6.0)適宜A.citrulli生長(zhǎng),而pH低于4.0時(shí)A.citrulli生長(zhǎng)有停滯消亡的趨勢(shì)。

3 討論

本項(xiàng)研究首次比較系統(tǒng)地監(jiān)測(cè)了不同溫度條件下,西瓜發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液中西瓜嗜酸菌的增殖動(dòng)態(tài),分析了不同發(fā)酵條件對(duì)種子感染病菌的影響。研究表明,發(fā)酵液中西瓜嗜酸菌迅速增殖,并在發(fā)酵24 h時(shí)可以侵染至種子內(nèi)部種皮與種仁,發(fā)酵溫度對(duì)A.citrulli侵染種子的影響不大。

圖4 發(fā)酵液pH與發(fā)酵液Acidovorax citrulli菌量的 相關(guān)回歸曲線Fig.4 Regression analysis between pH value and Acidovorax citrulli cell density in fermentation liquid

已有研究報(bào)道認(rèn)為A.citrulli感染西瓜種子的途徑有兩類(lèi):(1)發(fā)病果實(shí)引起種子帶菌。Rane和Latin[10]發(fā)現(xiàn)田間自然發(fā)病與人工接種后表現(xiàn)癥狀的果實(shí)采收的種子種皮和內(nèi)部胚可攜帶病菌,而無(wú)癥狀表現(xiàn)的果實(shí)采收的種子則沒(méi)有傳帶A.citrulli。(2)不發(fā)病潛伏感染的果實(shí)也可產(chǎn)生帶菌的種子。近年來(lái)美國(guó)Walcott研究組發(fā)現(xiàn):溫室條件下接種花的雌蕊柱頭,雖然果實(shí)不表現(xiàn)癥狀,但果瓤和種子均帶菌[11-13]。通過(guò)以上研究推斷通過(guò)雌花的柱頭感染A.citrulli是田間產(chǎn)生無(wú)癥狀果實(shí),造成種子內(nèi)部帶菌,引起病害流行的原因。然而值得注意的試驗(yàn)細(xì)節(jié)是花接種的濃度在107～109cfu/mL,在田間無(wú)病害癥狀表現(xiàn)或病害大規(guī)模流行的情況下,這樣高濃度的菌量落到雌蕊的幾率很小,在這樣的制種田間采收到的帶菌種子,其實(shí)際感染源有待討論。

然而西瓜種子除了在發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到感染以外,也有可能在采收和制種過(guò)程中受到感染。從西瓜果實(shí)取出果瓤和種子后,一般經(jīng)24 ～ 48 h發(fā)酵,清洗,干燥的過(guò)程。制種者將包裹著種子的瓜肉堆積,通過(guò)發(fā)酵,使西瓜果肉與種子徹底脫離,便于種子的收集,也有利于種子內(nèi)部代謝,便于種子萌發(fā)[14]。然而西瓜采收過(guò)程中,易混入土壤,雜草或潛伏感染的果實(shí)。雖然Hopskin等[15]報(bào)道認(rèn)為發(fā)酵使 pH降低,并不適合病原菌生存,本項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的pH逐漸降低,然而發(fā)酵前期A.citrulli快速繁殖,大大增加了對(duì)健康西瓜種子的感染幾率,不僅是種子外部的附著,也伴隨著內(nèi)部種皮與種仁的侵染。發(fā)酵24 h后種皮內(nèi)部帶菌率10%,種仁帶菌率1%,由此推測(cè)病菌通過(guò)氣孔,種臍進(jìn)入種子內(nèi)部。

現(xiàn)有種子處理方式,無(wú)論物理方法或是化學(xué)方法,主要針對(duì)種子外部攜帶真菌及細(xì)菌,對(duì)于種子內(nèi)部帶菌目前沒(méi)有十分有效的種子處理方法。發(fā)酵作為西瓜種子采收的步驟增加了細(xì)菌性果斑病的感染幾率,為了從初侵染源防控這一重要的檢疫性病害的種子傳帶,建議在發(fā)酵過(guò)程中使用果膠酶以縮短發(fā)酵時(shí)間,或者加入適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)藥劑殺菌。