董 敏, 杜立嘯, 袁洪振, 夏延穎, 司軍紅, 董文慧

(1. 山東鴻林工程技術(shù)有限公司, 濟(jì)南 250101; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 北京 100193)

懸鈴木方翅網(wǎng)蝽Corythuchaciliata屬半翅目網(wǎng)蝽科,原分布于北美和加拿大中東部[1],1964年經(jīng)意大利在歐洲迅速蔓延[2-3]。目前在南美洲、亞洲和澳洲也已發(fā)現(xiàn)大面積為害現(xiàn)象[4-5]。我國(guó)在2006年于武漢首次發(fā)現(xiàn)懸鈴木方翅網(wǎng)蝽,隨后在上海、杭州、南京、重慶、武漢等長(zhǎng)江流域多個(gè)城市發(fā)生危害,形成了暴發(fā)態(tài)勢(shì)[6]。國(guó)家林業(yè)局隨即將懸鈴木方翅網(wǎng)蝽增列入我國(guó)林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物名單,并要求各地監(jiān)測(cè)和防治。懸鈴木方翅網(wǎng)蝽具有傳播速度快、為害嚴(yán)重等特點(diǎn),被認(rèn)為是危險(xiǎn)入侵物種,一旦傳入到新的地區(qū),短時(shí)間內(nèi)可形成穩(wěn)定的高密度種群[7-10],成為入侵地懸鈴木的常發(fā)性主要害蟲[11-13],暴發(fā)時(shí)難以控制[14]。懸鈴木是我國(guó)常見的城市綠化植物,廣泛種植于中東部地區(qū),具有特殊的美化和人文價(jià)值,懸鈴木方翅網(wǎng)蝽嚴(yán)重影響著城市形象,給居民生活和城市管理帶來了巨大困擾,因此急需尋找一種安全有效的防治方法。

嗅覺對(duì)昆蟲的生存繁衍至關(guān)重要,它在昆蟲尋找食物、配偶、產(chǎn)卵和發(fā)育場(chǎng)所、躲避敵害等方面發(fā)揮重要作用[15-16]。氣味受體(odorant receptor)是嗅覺系統(tǒng)的關(guān)鍵成分之一,是了解昆蟲化學(xué)信號(hào)分子識(shí)別機(jī)制的重要基礎(chǔ)[17-19],對(duì)氣味受體的研究可為懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的防治提供新的思路和途徑。本研究采用RT-PCR技術(shù),克隆獲得懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因,利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其序列進(jìn)行分析,并與其他昆蟲Orco基因同源性進(jìn)行了比較,以期為進(jìn)一步研究懸鈴木方翅網(wǎng)蝽嗅覺通訊分子機(jī)制和尋求新的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽防治技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣本與試劑

懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲采自山東省濟(jì)南市歷城區(qū)郭店鎮(zhèn)相公莊區(qū)域山東鴻林工程技術(shù)有限公司的苗圃園內(nèi)。將采集到的成蟲存放于白色透明塑料盒中,用新鮮懸鈴木葉片飼喂,放置于人工培養(yǎng)箱中,溫度(27±1)℃、濕度60%。取300頭成蟲的觸角,用鑷子將其頭和觸角一同夾下,立刻置于液氮中研磨至粉狀,轉(zhuǎn)入裝有1 mL TRIzol的EP管中,-70℃保存至RNA提取。

總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司;First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司;PCR試劑購(gòu)自TaKaRa公司;普通瓊脂糖膠回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-Blunt Vector、抗生素類、X-gal、IPTG均購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司;GoTaq qPCR Master Mix購(gòu)自Promega公司;其他均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?引物合成、測(cè)序由華大基因生物技術(shù)公司完成。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 中已發(fā)表的半翅目昆蟲中黑盲蝽Adelphocorissuturalis(GenBank: KC881257)、綠盲蝽Apolyguslucorum(GenBank: KC881255)、豆莢草盲蝽Lygushesperus(GenBank: JQ639213)、美國(guó)牧草盲蝽Lyguslineolaris(GenBank: JQ639214)等非典型氣味受體家族基因的氨基酸保守序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因的簡(jiǎn)并引物,上游引物:5′-ATGATGACCAARGTGAARGC-3′;下游引物:5′-TTAYTTGAGYTGTAYCAAYACCATG-3′。

1.3 總RNA提取和cDNA的合成

使用TRIzol試劑提取1.1節(jié)中收集的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲頭部和觸角的總RNA,提取步驟參照說明書。提取的總RNA濃度和質(zhì)量通過NanoDrop-2000(NanoDrop Products)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取1 μg總RNA,以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA,試驗(yàn)操作依照First Strand cDNA Synthesis Kit使用手冊(cè)。

1.4 基因克隆

以懸鈴木方翅網(wǎng)蝽頭部及觸角cDNA為模板,利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增CcilOrco的完整開放閱讀框序列。反應(yīng)體系為:2×PrimeStar Premix 25 μL,cDNA 2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各2 μL,ddH2O補(bǔ)充至50 μL?；靹?短暫離心,放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán),循環(huán)條件為94℃ 15 s,55℃ 20 s,72℃ 45 s;最后72℃延伸5 min。將產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體并測(cè)序。

1.5 序列分析

通過DNAMAN、Gendoc等軟件對(duì)測(cè)序獲得的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析;利用NCBI上BLAST工具進(jìn)行同源性比對(duì);使用EXPASY(Expert Protein Analysis System,http:∥www.expasy.org)的Translate tool(http:∥web.expasy.org/translate)將核酸序列翻譯成氨基酸序列,通過Compute pI/Mw工具(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn)。使用TMHMM(http:∥www.cbs.dtu.dk /services /TMHMM)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。使用Mega 6.0采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建進(jìn)化樹,分支的支持率通過bootstrap驗(yàn)證,重復(fù)次數(shù)1 000。

1.6 CcilOrco 基因表達(dá)分析

為了明確CcilOrco基因在雌雄成蟲不同部位表達(dá)量的差異,我們利用qPCR對(duì)該基因在雌雄成蟲觸角、頭(去除觸角)、胸、腹、足中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。根據(jù)獲得的CcilOrco基因的核酸序列,利用Primer 5設(shè)計(jì)特異引物,上游引物:5′-CTTCTGTTTCATTCGTCATATTTGCC-3′;下游引物:5′-ATCGTTTCCATCCCCATTGGTA-3′。內(nèi)參基因選用β-actin(GenBank: KX108734) 基因,上游引物:5′-CCAAGGCCAACAGAGAAAAGAT-3′;下游引物:5′-GATGGGCACAGTGTGGGAAA-3′。

收集200頭雌、雄成蟲的觸角, 200頭雌、雄成蟲的頭(去除觸角), 100頭雌、雄成蟲的胸,50頭雌、雄成蟲的腹,50頭雌、雄成蟲的足,液氮中研磨至粉狀,轉(zhuǎn)入裝有1 mL TRIzol的EP管中,-70℃保存至RNA提取,RNA提取的方法步驟同1.1。所有部位均取 1 μg 的RNA進(jìn)行cDNA 的合成,具體步驟同1.3。qPCR反應(yīng)體系為:GoTaq qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,cDNA 1 μL,無RNA酶的H2O 7.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 °C,2 min; 95 °C,15 s,60 °C,50 s,循環(huán)數(shù)為40。整個(gè)反應(yīng)在ABI 7500 Fast平臺(tái)上完成。將雌性成蟲觸角cDNA以10倍濃度進(jìn)行梯度稀釋,共8個(gè)濃度,并以此為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,以確定引物的特異性及擴(kuò)增效率。每個(gè)部位獨(dú)立重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行處理,采用SPSS 16.0進(jìn)行ANOVA比較不同組織間CcilOrco基因表達(dá)量的差異(LSD,P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽氣味受體基因CcilOrco序列分析

通過基因克隆獲得懸鈴木方翅網(wǎng)蝽氣味受體基因的序列,命名為CcilOrco(GenBank:MF564288)。如圖1所示。

圖1 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of the gene CcilOrco in Corythucha ciliate

CcilOrco開放閱讀框長(zhǎng)1 419 bp,編碼472個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其分子量為53.25 kD,等電點(diǎn)為6.22。利用TMHMM 2.0蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件分析,獲得的序列具有7個(gè)α螺旋跨膜區(qū)(圖2),跨膜區(qū)氨基酸的位置是47-69,74-96,135-157,204-226,344-366,376-398 和446-468,是一個(gè)典型的G蛋白偶聯(lián)受體,序列N-端在細(xì)胞膜內(nèi),C-端在細(xì)胞膜外。

2.2 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因氨基酸同源性比較

選取半翅目昆蟲綠盲蝽(AlucOrco:KC881255)、美國(guó)牧草盲蝽(LlinOrco:JQ639214);雙翅目昆蟲黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(DmelOrco: AY567998)、岡比亞按蚊Anophelesgambiae(AgamOrco: AY843205);鱗翅目昆蟲黃地老虎Agrotissegetum(AsegOrco:

KC526964)、桃蛀螟Conogethespunctiferalis(CpunOrco: JX101681)與懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因進(jìn)行序列比對(duì)分析,結(jié)果顯示,這8種昆蟲的Orco受體的C端序列具有高度的保守性(圖3)。

圖2 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 The predicted transmembrane domains of the olfactory co-receptor CcilOrco from Corythucha ciliate

圖3 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco與其他昆蟲氣味受體蛋白的序列比對(duì)Fig.3 Sequence alignment of Corythucha ciliate CcilOrco with olfactory receptors in other insects

為研究懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco與其他物種之間的進(jìn)化關(guān)系,利用Mega 6.0軟件鄰接法構(gòu)建半翅目、鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、直翅目、雙翅目部分昆蟲非典型氣味受體的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示,24個(gè)非典型嗅覺受體基因分成2個(gè)大的分支,不同目之間氨基酸序列差異較大,同一目昆蟲之間差異較小;懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco與麥長(zhǎng)管蚜SaveOrco、綠盲蝽AlucOrco、豆莢草盲蝽LhesOrco、美國(guó)牧草盲蝽LlinOrco聚為一類,它們都屬于半翅目昆蟲非典型氣味受體,相似性較高。而與其他目昆蟲遺傳距離較遠(yuǎn),相似性很低。

圖4 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽與其他昆蟲Orco氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Corythucha ciliate Orcos and those from other insects based on amino acid sequence

2.3 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因在不同部位表達(dá)分析

采用qPCR對(duì)懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因在雌雄成蟲不同部位的表達(dá)情況進(jìn)行了比較分析。以雌成蟲觸角不同濃度的cDNA為模板,進(jìn)行qPCR,根據(jù)CT值得到懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因和β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 6和0.999 7,擴(kuò)增效率分別為102%和103%,符合試驗(yàn)的要求。

以雌蟲和雄蟲足中CcilOrco基因的表達(dá)量為1,分別對(duì)雌蟲和雄蟲其他部位中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果顯示,CcilOrco基因在雌性和雄性成蟲之間表達(dá)模式一致,均在觸角中表達(dá)量最高,顯著高于其他部位;其次為頭部,在胸、腹和足中的表達(dá)量最低,且三者之間不存在顯著性差異(圖5)。

圖5 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco的表達(dá)分析Fig.5 Expression profile of CcilOrco in different parts of Corythucha ciliate

3 結(jié)論與討論

目前,隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,多種昆蟲的觸角轉(zhuǎn)錄組被測(cè)定出來,利用昆蟲各物種之間的保守區(qū)域進(jìn)行同源克隆的方法,已從鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、直翅目等8個(gè)目的多種昆蟲發(fā)現(xiàn)了非典型氣味受體基因,并且在不同昆蟲之間其序列相似性很高。本研究通過RT-PCR技術(shù)獲得懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilOrco基因的cDNA序列,其編碼的氨基酸序列與半翅目昆蟲麥長(zhǎng)管蚜SaveOrco、綠盲蝽AlucOrco、豆莢草盲蝽LhesOrco、美國(guó)牧草盲蝽LlinOrco等同源性水平很高,與雙翅目等昆蟲的非典型氣味受體也有高的同源性,這些都與Orco基因在不同昆蟲體內(nèi)的保守性相吻合。通過qPCR發(fā)現(xiàn)CcilOrco基因主要在雌雄成蟲觸角中高表達(dá),在去除觸角的頭部表達(dá)量同樣顯著高于胸、腹和足等非嗅覺組織。這可能和其與ORx的共表達(dá)有關(guān),目前的研究發(fā)現(xiàn),絕大部分ORx主要在觸角、喙、下唇須等嗅覺組織中表達(dá)。

Orco與普通氣味受體ORx共表達(dá),形成一個(gè)異源二聚體結(jié)構(gòu),這樣可以極大地提高ORx對(duì)氣味的結(jié)合反應(yīng)能力,但它對(duì)ORx的配體結(jié)合范圍并無任何影響[20-22]。Larsson等[23]敲除果蠅Orco后發(fā)現(xiàn),果蠅對(duì)大部分氣味的電生理反應(yīng)喪失,同時(shí)這些氣味也無法引起果蠅相應(yīng)的行為反應(yīng);但進(jìn)行基因營(yíng)救試驗(yàn)后,果蠅對(duì)這些氣味的電生理反應(yīng)和行為反應(yīng)又得到了恢復(fù)。類似的研究在赤擬谷盜、黃曲條跳甲等昆蟲的Orco中也得到了相似的結(jié)果[24]。Orco在昆蟲嗅覺識(shí)別過程中發(fā)揮著重要的作用,但其本身并不與任何配體結(jié)合。在對(duì)果蠅Or22a/b基因突變體中,只表達(dá)Orco的嗅覺神經(jīng)神經(jīng)元對(duì)測(cè)試的氣味化合物無任何生理學(xué)反應(yīng)[25]。

目前已被證實(shí),VUAAI是Orco的興奮劑,它可以通過激活Orco從而激發(fā)幾乎所有嗅覺神經(jīng)元的活性,進(jìn)而喪失對(duì)不同氣味物質(zhì)的區(qū)分,抑制昆蟲嗅覺誘發(fā)的行為反應(yīng)[26]。隨后的研究也發(fā)現(xiàn)了多種Orco的抑制劑[27-28],這些研究為以O(shè)rco為靶標(biāo)的害蟲防治提供了基礎(chǔ)。本研究對(duì)懸鈴木方翅網(wǎng)蝽氣味受體CcilOrco基因的成功克隆,為懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的防控提供新的理論基礎(chǔ),具有重要的實(shí)踐意義。