陳潔瀅， 孫亞楠， 邵文涵， 池曉娟， 陳吉龍， 王 松

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002)

番鴨呼腸孤病毒病是由番鴨呼腸孤病毒(MDRV)引起的一種以腳軟、肝脾有大量白色壞死點、高發(fā)病率和高病死率為特征的新的急性傳染病，對番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成極為重大的經(jīng)濟損失。機體天然免疫系統(tǒng)是抗病毒感染的第一道防線，病毒感染宿主后，天然免疫系統(tǒng)會被激活，經(jīng)細(xì)胞中一系列的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)宿主分泌多種抑制病毒的細(xì)胞因子。干擾素(Interferon，IFN)是最重要的細(xì)胞因子之一，在抵抗病毒的過程中發(fā)揮著重要作用，干擾素可以與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，進而誘導(dǎo)上千種干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表達[1]。MDRV感染后能迅速激活宿主天然免疫信號通路，誘導(dǎo)IFNs及某些重要ISGs的大量表達[2]。從ISGs被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外學(xué)者不斷探索ISGs在病毒侵襲宿主過程中發(fā)揮的作用及作用機理，目前對包括Viperin在內(nèi)的少數(shù)ISGs的抗病毒機制有較深入的了解[3]。

Viperin，也被稱為cig5和RSAD2，是一種重要的ISGs，是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的抗病毒蛋白，可被干擾素、細(xì)菌脂多糖(LPS)、poly ( I ∶ C) 和多種病毒等誘導(dǎo)表達，具有廣譜抗病毒活性[4]，對淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)[5]、丙型肝炎病毒(HCV)[6]、登革熱病毒(DENV)[7]、基孔肯雅病病毒(CHIKV)[8]、仙臺病病毒(SeV)[9]、A型流感病毒(IAV)[10]、日本腦炎病毒( JEV)[11]、人類免疫缺陷病毒(HIV)[12]和西尼羅河病病毒(WNV)[13]等多種病毒具有抑制作用。但目前還未有文獻報道番鴨Viperin蛋白在番鴨體內(nèi)的表達情況，以及其對MDRV復(fù)制影響的相關(guān)研究。本研究首先檢測了番鴨Viperin基因在感染MDRV細(xì)胞和雛番鴨組織中的表達情況；然后，克隆番鴨Viperin 基因到真核表達質(zhì)粒，并對Viperin在MDRV復(fù)制中的作用進行了研究。本研究首次證實番鴨Viperin蛋白具有抗MDRV的作用，為抗MDRV藥物的篩選和研制提供了新的選擇，也為番鴨Viperin 蛋白抗病毒活性的初步評價提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞、病毒、實驗動物和菌株 293T細(xì)胞，由本實驗室保存；番鴨鴨胚成纖維細(xì)胞(MDEF)，分離自11～13日齡的番鴨胚；MDRV病毒YB株，由福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院吳寶成老師惠贈；番鴨購自廣東溫氏食品集團有限公司莆田分公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自天根生化科技( 北京) 有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 DMEM、胎牛血清，Gibco 公司生產(chǎn)； 核酸限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 連接酶、Pyrobest 高保真DNA 聚合酶、Taq酶、Oligo d( T) 18 Primer、Recombinant Dnase I、Cloned Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mixture、核酸Marker，均由TaKaRa 公司生產(chǎn)；真核轉(zhuǎn)染試劑VigoFect，威格拉斯生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；NC膜，Millipore 公司生產(chǎn)；蛋白預(yù)染Marker，Thermo Scientific 公司生產(chǎn)；ECL 化學(xué)發(fā)光液，普利萊基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Flag 標(biāo)簽抗體、過硫酸銨和十二烷基磺酸鈉，均由Sigma 公司生產(chǎn)； 羊抗鼠二抗，Santa Cruz 公司生產(chǎn)；丙烯酰胺，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器 細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(型號為MCO175)，SANYO 公司生產(chǎn)；生物安全柜(型號為Biobase BSC-1100IIA2-X)，BioBase 公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡(型號為Ti-E)，Nikon公司生產(chǎn)；普通離心機(型號為Micro-17 )、冷凍離心機(型號為Theromo Fisher labofuge 400R)，均由Thermo Scientific公司生產(chǎn)；低溫離心機(型號為Eppendorf 5424R)由Eppendorf公司生產(chǎn)；普通PCR儀(型號為T100)、凝膠成像系統(tǒng)(型號為GeIDoc XR + )，均由Bio-Rad公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀(LightCycler?96)，由羅氏公司生產(chǎn)；化學(xué)發(fā)光和多色熒光成像系統(tǒng)(FluorChem M)，由美國ProteinSimple公司生產(chǎn)；水平電泳槽、電泳儀(型號為BG-MIDI)，均由北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號為GRP-9080)，上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司生產(chǎn)；恒溫?fù)u床(型號為ZWY-240)，太倉市科教器材廠華利達實驗設(shè)備公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計 從NCBI上查找目的基因mRNA序列，由于沒有番鴨序列，所以根據(jù)綠頭鴨Viperin (登錄號為KP198582.1) mRNA序列設(shè)計克隆引物1對，在5′端和3′端分別引入EcoRⅠ(GAATTC)和BamHⅠ(GGATCC) 酶切位點；再設(shè)計RT-PCR 引物1對。根據(jù)MDRV的結(jié)構(gòu)蛋白P10 (登錄號為 EF547375.1) mRNA 序列設(shè)計RT-PCR引物1對。根據(jù)人GAPDH (登錄號為KJ891221.1) mRNA 序列設(shè)計RT-PCR 引物1對。根據(jù)番鴨actin(登錄號為 KY352479.1) mRNA序列設(shè)計RT-PCR 引物1對。

設(shè)計的引物序列見表1。

表1 引物序列信息

h：人源引物 ； d：鴨源引物

2.2 番鴨Viperin 編碼區(qū)序列的PCR擴增 從番鴨脾臟中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此cDNA 為模板，PCR擴增Viperin編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，回收目的條帶。

2.3 真核表達載體的構(gòu)建 將PCR擴增獲得的Viperin基因和pFlag-CMV-5a 載體分別經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后純化、回收，再用T4 DNA 連接酶將目的片段和載體的雙酶切產(chǎn)物在16 ℃條件下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，通過瓊脂糖凝膠電泳跑膠篩選重組質(zhì)粒。

2.4 克隆質(zhì)粒的鑒定EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，電泳鑒定；并將重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將構(gòu)建成功的含番鴨Viperin基因質(zhì)粒命名為pFlag-CMV-Viperin。

2.5 真核表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 待293T 細(xì)胞密度為80%～90%時，將舊培養(yǎng)基更換成轉(zhuǎn)染液( 無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基)，取3 μg pFlag-CMV-Viperin，加入轉(zhuǎn)染液中至總體積為50 μL，輕輕混勻；取VigoFect 2μL，加入轉(zhuǎn)染液中至總體積為50 μL，輕輕混勻，室溫放置5 min；將含有VigoFect的轉(zhuǎn)染液逐滴加入稀釋的DNA溶液中，輕輕混勻，室溫放置20 min；將混合液逐滴加入細(xì)胞中，輕輕搖勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后更換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，獲得過表達Viperin和空載體pFlag-CMV-5a的293T細(xì)胞。這兩種細(xì)胞感染同劑量的MDRV(MOI為1)，收集感染24 h后的細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用RT-PCR和qRT-PCR檢測細(xì)胞中Viperin的表達量和病毒基因P10的表達水平。

2.6 RT-PCR檢測Viperin基因的表達 提取細(xì)胞/組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此cDNA 為模板，PCR擴增Viperin、P10和GAPDH /actin基因。PCR反應(yīng)條件為：9 5℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。以Actin為內(nèi)參基因，1.2%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，觀察目的條帶的灰度值，進而分析判斷目的基因mRNA 的表達情況。

2.7 Western-Blot檢測Viperin蛋白的表達 收獲細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白。10% SDS-PAGE電泳分離目的蛋白并轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗用1×TBS 適當(dāng)稀釋，室溫下?lián)u動孵育2～4 h；二抗用3%脫脂牛奶稀釋，室溫下?lián)u動孵育2～4 h。用1×TBS洗膜3次，10min/次；最后用化學(xué)發(fā)光顯色液沖洗膜5 min，曝光并分析結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 MDRV感染能夠誘導(dǎo)Viperin高表達 MDRV感染293T細(xì)胞和MDEF細(xì)胞，分別感染不同時間后收集細(xì)胞樣品，提取RNA，檢測Viperin的變化情況。結(jié)果顯示，隨著病毒復(fù)制量的增多，Viperin表達量也呈上升的趨勢(圖1A、B)。此外，用MDRV感染5日齡的雛番鴨，總感染時間為4 d，每隔1 d處死番鴨并收取脾臟來檢測病毒P10和Viperin的表達量。結(jié)果顯示，番鴨脾臟中Viperin的表達量在MDRV感染后有明顯的升高，與細(xì)胞水平一致(圖1C)。由此說明Viperin的表達與MDRV的增殖可能有著一定的關(guān)系。

圖1MDRV感染293T、MDEF和番鴨后P10和Viperin表達量

3.2 重組質(zhì)粒pFlag-CMV-Viperin的構(gòu)建 為了進一步研究Viperin基因在MDRV感染機體過程中發(fā)揮的作用，我們構(gòu)建了番鴨Viperin基因真核表達質(zhì)粒：采用RT-PCR方法從番鴨脾臟組織中擴增得到1條長度約為1 000 bp的特異條帶(圖2)，與預(yù)期片段大小相符。利用EcoR I 酶和BamH I 酶雙酶切PCR獲得的Viperin基因片段，同時用這2種酶雙酶切pFlag-CMV-5a載體，將回收的基因片段與載體片段連接，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，再利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I對質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，可以獲得預(yù)期約1 100 bp大小的目的片段(圖3)。最后，將該質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序得到的質(zhì)粒基因序列與綠頭鴨Viperin的基因序列相似度為97.12%，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pFlag-CMV-Viperin。

圖2 番鴨Viperin編碼區(qū)序列的PCR擴增

圖3 重組質(zhì)粒pFlag-CMV-Muscovy-Viperin的酶切鑒定

3.3 重組質(zhì)粒蛋白表達水平的檢測 由于番鴨鴨胚成纖維細(xì)胞無法傳代培養(yǎng)，且原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，因此選擇在293T模式細(xì)胞中檢測番鴨Viperin重組質(zhì)粒的表達情況。pFlag-CMV-Viperin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后收取細(xì)胞制備蛋白樣，Western-Blot 檢測Viperin蛋白表達水平。pFlag-CMV-Viperin帶有Flag標(biāo)簽，因此一抗采用Flag標(biāo)簽抗體。結(jié)果顯示，pFlag-CMV-Viperin重組質(zhì)粒能夠在293T細(xì)胞中大量表達(圖4) 。

圖4 Viperin 蛋白表達水平的檢測

3.4 番鴨Viperin蛋白具有抗MDRV增殖的作用 基于成功構(gòu)建了過表達番鴨Viperin的質(zhì)粒，我們對其在MDRV復(fù)制過程中的功能進行了研究。將pFlag-CMV-Viperin和空載體pFlag-CMV-5a分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，24 h后感染MDRV(MOI =1)，感染24 h后收樣，提取總RNA，用RT-PCR和qRT-PCR檢測細(xì)胞中病毒P10基因的表達情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pFlag-CMV-Viperin的P10基因表達量明顯低于對照組。因此說明，番鴨Viperin蛋白對MDRV的增殖起到抑制作用(圖5)。

圖5 過表達Viperin抑制了MDRV在293T細(xì)胞中的復(fù)制

4 討論

番鴨呼腸孤病毒病在福建、廣東和浙江等多個省份暴發(fā)，對我國番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[15]，研制高效低毒的抗MDRV藥物勢在必行。先天免疫因子Viperin是一種可被干擾素、多種病毒、細(xì)菌脂多糖(LPS)等誘導(dǎo)表達的與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的抗病毒蛋白，具有廣譜抗病毒活性。Viperin在抑制包括DNA和RNA病毒，細(xì)菌和寄生蟲在內(nèi)的廣泛的微生物入侵中扮演著重要角色。

本研究發(fā)現(xiàn)番鴨Viperin基因在感染MDRV的細(xì)胞和組織中大量表達，為了探明該現(xiàn)象與病毒復(fù)制的相關(guān)性，我們構(gòu)建了番鴨Viperin 基因真核表達質(zhì)粒，對其功能進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番鴨Viperin蛋白在MDRV感染過程中發(fā)揮了重要作用：能夠顯著抑制MDRV的復(fù)制。后續(xù)工作可以聚焦于番鴨Viperin蛋白具體的作用機制及其調(diào)控的相關(guān)信號通路，以期更加全面地了解番鴨Viperin蛋白抗MDRV的分子機制。這將為闡明MDRV與宿主相互作用機制及病毒的致病機理提供重要科學(xué)依據(jù)，同時也為新型抗MDRV藥物的研發(fā)提供理論參考。