李紫薇， 劉 偉， 歐陽艷， 徐維義

(伊犁師范學院化學與環(huán)境科學學院，新疆伊寧 835000)

花色苷作為一種天然食用色素，資源豐富、安全，而且具有一定的營養(yǎng)和藥理作用，但其很容易變色，穩(wěn)定性受到很多因素影響，如酸堿度變化、氧化劑、酶、金屬離子、溫度和光照等，在一定程度上限制了其廣泛應用。野生櫻桃李(PrunusdivaricataEhrh.)系薔薇科李屬落葉灌木或小喬木，是世界上極為珍貴并且瀕臨滅絕的原始野生林果[1-4]。野生櫻桃李成熟果實的顏色可分為紫、紅、黃3大類型。紫果的色價較高，含有矢車菊3-半乳糖苷、矢車菊3-葡萄糖苷、矢車菊 3- 蕓香糖苷、矢車菊(乙?；?3-葡萄糖苷[5]。目前已有關(guān)于野生櫻桃李紫果色素的提取、穩(wěn)定性和抗氧化活性[6-8]等研究，但對野生櫻桃李花色苷的輔色作用研究未見報道。

本研究選取7種有機酸(草酸、丙二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、丁二酸、甘氨酸)和3種糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)，研究其在鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)緩沖溶液體系(pH值=3、4)和醋酸-醋酸鈉(HAc-NaAc)緩沖溶液體系(pH值=4)中對野生櫻桃李花色苷的輔色作用，旨在為野生櫻桃李色素在食品加工中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生櫻桃李于2016年9月初采自新疆伊犁霍城縣大西溝，洗凈、剝皮，果皮烘干后粉碎，過60目篩備用。D101大孔樹脂，購自鄭州勤實科技有限公司；無水乙醇、氯化鉀、鹽酸、無水乙酸鈉、丁二酸、甘氨酸、草酸、丙二酸、DL-蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、鄰苯二甲酸氫鉀、葡萄糖、果糖、蔗糖和亞硝酸鈉，均為分析純。實驗用水為去離子水。

UV-3900紫外可見分光光度計，日本日立高技術(shù)公司生產(chǎn)；723PC可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司生產(chǎn)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；TD25-WS多管架自動離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn)；XH-2008D型電腦智能溫控超聲波合成萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；PHSJ-5 pH計，上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn)；FA2104N電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生櫻桃李花色苷的制備 以鹽酸-乙醇溶液(鹽酸濃度為0.1 mol/L，乙醇體積分數(shù)為50%)為提取劑，提取野生櫻桃李紫果皮中花色苷，料液比為1 g ∶25 mL，超聲波功率為 250 W，浸提15 min。抽濾后收集濾液，將濾液在0 ℃左右低溫冷置6 h，離心(4 000 r/min，15 min)，收集上清液，于50 ℃減壓濃縮。粗提物過D101大孔樹脂柱，以體積分數(shù)80%乙醇為洗脫劑，將所得洗脫液于50 ℃以下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥后得暗紫紅色花色苷提取物[6]。

1.2.2 花色苷含量的測定 本試驗采用pH值示差法測定野生櫻桃李花色苷含量[9-11]，參考宋德群等對藍莓花色苷含量測定用的pH值示差法中緩沖液配制方法[12]。具體花色苷含量計算公式如下：

(1)

ΔD=(D520 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0)-(D520 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5)。

(2)

式中：D為吸光度；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(26 900)；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量(449.2)；V為溶液體積，mL；m為純化后的花色苷粉末質(zhì)量，g；L為光程(1 cm)。此外，以緩沖溶液作參比，用D700 nm來消除樣液混濁的影響。

1.2.3 不同緩沖溶液體系中有機酸對野生櫻桃李花色苷的輔色效果 以KHP緩沖溶液(pH值=3.0)為溶劑，分別配制 0.200 mol/L 草酸、丙二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、丁二酸、甘氨酸7種有機酸儲備液。取1 mL花色苷溶液于10 mL容量瓶中，加入一定體積0.200 mol/L有機酸作為輔色劑，用KHP緩沖溶液定容至10 mL，研究不同濃度各有機酸對野生櫻桃李花色苷的輔色效果。各有機酸系列濃度分別為0、1.0×10-2、3.0×10-2、5.0×10-2、7.0×10-2、9.0×10-2、1.0×10-1mol/L，花色苷濃度為4.3×10-3mol/L(以矢車 菊-3-葡萄糖苷計)，將有機酸-花色苷混合溶液靜置2 h，以緩沖溶液為參比，于520 nm處測吸光度。參考顧林等的計算方法[13-14]，有機酸對野生櫻桃李花色苷的輔色效果以/mol有機酸引起的野生櫻桃李花色苷吸光度增加量，即用輔色度(I)表示：

(3)

式中：D520 nm(0)、D520 nm分別為加入有機酸前、后野生櫻桃李花色苷溶液的吸光度；C為有機酸濃度(mol/L)。

有機酸濃度為0.09 mol/L，花色苷濃度為4.3×10-3mol/L，將各有機酸與花色苷的混合溶液(pH值=3.0)分別置于15、20、25、35、45、55、65 ℃恒溫水浴2 h，以pH值=3.0的KHP緩沖溶液為參比測吸光度，重復3次。

參照上述方法，分別考察各有機酸在KHP緩沖溶液體系(pH值=4)和HAc-NaAc緩沖溶液體系(pH值=4)中對花色苷的輔色效果。

1.2.4 不同緩沖溶液體系中糖對野生櫻桃李花色苷的輔色效果 以KHP緩沖溶液(pH值=3.0)為溶劑，分別配制 0.200 mol/L 葡萄糖、蔗糖、果糖儲備液。吸取1 mL花色苷溶液7份，加入0.200 mol/L葡萄糖作為輔色劑，緩沖溶液稀釋并定容至10 mL，使花色苷濃度為4.3×10-3mol/L，各糖系列濃度分別為0.0、1.0×10-2、3.0×10-2、5.0×10-2、7.0×10-2、9.0×10-2、1.0×10-1mol/L。將花色苷-糖溶液靜置2 h，以緩沖溶液為參比，于520 nm處測吸光度，重復3次，研究不同濃度葡萄糖對野生櫻桃李花色苷的輔色效果。將 4.3×10-3mol/L花色苷和0.09 mol/L糖混合溶液分別置于15、20、25、35、45、55、65 ℃恒溫水浴鍋中，恒溫2 h后測其吸光度。以緩沖溶液為參比，測定波長為520 nm，并與未輔色的花色苷溶液對照試驗，重復3次，考察溫度對輔色效果的影響。參照上述方法，分別考察葡萄糖、蔗糖、果糖在KHP緩沖溶液體系(pH值=4)和HAc-NaAc緩沖溶液體系(pH值=4)中對花色苷的輔色效果以及溫度對輔色效果的影響。

1.2.5 糖與亞硝酸鈉共存時的輔色效果 設花色苷濃度為 4.3×10-3mol/L，亞硝酸鈉濃度分別是0.0、1.0×10-2、3.0×10-2、5.0×10-2、7.0×10-2、9.0×10-2、1.0×10-1mol/L，野生櫻桃李花色苷溶液與亞硝酸鈉溶液一經(jīng)混合即刻測定吸光度，比較不同濃度亞硝酸鈉在3種緩沖溶液體系中對花色苷的氧化降解作用。在KHP緩沖溶液體系(pH值=3)中，蔗糖、果糖、葡萄糖濃度為0.09 mol/L，考察糖與亞硝酸鈉共存時對花色苷的輔色效果，測定波長為 520 nm，繪制動力學曲線，重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷含量的測定

準確稱取0.050 0 g制備的花色苷粉末，用KHP緩沖溶液(pH值=3)溶解并定容至100 mL。移取5 mL該色素溶液于50 mL容量瓶中，平行2份，分別用氯化鉀-鹽酸(pH值=1.0)和醋酸鈉-鹽酸的緩沖溶液(pH值=4.5)稀釋定容，靜置2 h后在520、700 nm處測吸光度。本試驗采用pH值示差法測定花色苷含量，根據(jù)公式(1)和公式(2)，測得野生櫻桃李花色苷的含量為38.27 mg/g。

2.2 有機酸對野生櫻桃李花色苷的輔色作用

2.2.1 不同pH值的緩沖溶液中有機酸的輔色效果 本試驗考察了草酸、丙二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、丁二酸和甘氨酸在3種緩沖體系中對野生櫻桃李花色苷的輔色效果。由圖1可知，在研究的7種有機酸中，除甘氨酸外，其他6種有機酸在考察的濃度范圍內(nèi)具有輔色作用，其原因可能是幾種有機酸與野生櫻桃李花色苷形成了氫鍵，從而產(chǎn)生了輔色和穩(wěn)定作用。有機酸的濃度為0.01～0.03 mol/L時，對野生櫻桃李花色苷的輔色度最大，有機酸濃度為0.03 mol/L時，在KHP緩沖溶液體系(pH值=3)中有機酸輔色度相對大小排列是草酸>丙二酸>檸檬酸、酒石酸、丁二酸>蘋果酸、甘氨酸；在KHP緩沖溶液體系(pH值=4)中有機酸輔色度相對大小排序是草酸>檸檬酸>丙二酸>酒石酸>蘋果酸>丁二酸>甘氨酸；在HAc-NaAc緩沖體系(pH值=4)中有機酸輔色度相對大小排序是：草酸>丙二酸>酒石酸、檸檬酸>蘋果酸>丁二酸>甘氨酸。綜上可以看出，在研究的7種有機酸中，草酸的輔色作用最強，甘氨酸的輔色作用最弱。pH值為3時，野生櫻桃李花色苷溶液較pH值為4時的顏色深，有機酸在pH值=4的2種緩沖溶液中的輔色度明顯大于在pH 值=3的KHP緩沖體系中的輔色度。由于花色苷在pH值=3的緩沖溶液體系中吸光度最大最穩(wěn)定，故后續(xù)選取pH值=3的KHP緩沖體系進行試驗。

2.2.2 不同溫度有機酸的輔色作用 在KHP緩沖體系(pH值=3)中，考察了0.09 mol/L有機酸在不同溫度下對野生櫻桃李花色苷的輔色效果。在考察的溫度范圍內(nèi)，野生櫻桃李花色苷經(jīng)草酸、丙二酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、 丁二酸輔色處理后的熱穩(wěn)定性有不同程度的提高，其中草酸、丙二酸、檸檬酸、酒石酸對花色苷的熱穩(wěn)定性影響最大。

2.3 葡萄糖、果糖、蔗糖對花色苷的輔色作用

2.3.1 不同pH值緩沖溶液中糖對花色苷的輔色效果 如圖2所示，室溫條件下，在考察的濃度范圍內(nèi)，葡萄糖、果糖、蔗糖對野生櫻桃李花色苷的輔色作用不明顯。

2.3.2 不同溫度下糖對花色苷的輔色作用 在不同溫度條件下，本試驗考察了0.09 mol/L葡萄糖、果糖、蔗糖對花色苷的輔色效果。如圖3所示，野生櫻桃李花色苷的降解速度隨著溫度的升高而加快。葡萄糖、果糖、蔗糖的存在對野生櫻桃李花色苷的熱穩(wěn)定性是不利的。有研究表明，果糖較葡萄糖和蔗糖會更容易地轉(zhuǎn)化為糠醛類物質(zhì)，降解效果比葡萄糖、蔗糖要大一些，但是由于每種植物所含花色苷組分和成分背景不同，穩(wěn)定性也不同[15]。在本試驗體系中，葡萄糖和果糖對野生櫻桃李花色苷的降解作用無明顯差異，且這2種糖對花色苷的促降解作用大于蔗糖。溫度大于35 ℃時，葡萄糖、果糖對花色苷的促降解作用較低溫時明顯。蔗糖在溫度大于55 ℃時，表現(xiàn)出對花色苷的輕微護色作用。

2.3.3 糖與亞硝酸鈉共存時的輔色作用 葡萄糖、果糖、蔗糖雖然對花色苷沒有明顯的輔色作用，但根據(jù)相關(guān)報道，葡萄糖和蔗糖能夠提高花色苷的穩(wěn)定性。本試驗進一步考察了糖在與亞硝酸鈉共存時，對野生櫻桃李花色苷的輔色作用。如圖4所示，亞硝酸鈉濃度越大，對花色苷的降解作用越明顯。

在KHP緩沖體系(pH值=3.0)中，0.09 mol/L糖與 0.18 mmol/L 亞硝酸鈉混合溶液在3 h后褪至無色。由圖5可知，葡萄糖、果糖和蔗糖在一定程度上能夠提高野生櫻桃花色苷的抗氧化作用，蔗糖的作用尤為明顯。這可能是由于糖類降低了水活度，水活度的降低會相應地導致花色苷的降解反應速率下降，當水成為一種限制因素時，花色苷發(fā)色團就不易水化生成無色化合物。

3 結(jié)論與討論

本研究比較了7種有機酸和3種糖在KHP緩沖體系(pH值=3、4) 和HAc-NaAc緩沖體系(pH值=4)中對野生櫻桃李花色苷的輔色作用。有機酸在pH值=4的2種緩沖溶液中的輔色度明顯大于在pH值=3的KHP緩沖體系中的輔色度。在研究的7種有機酸中除甘氨酸外，草酸、丙二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和丁二酸在考察的濃度范圍內(nèi)都具有輔色作用，有機酸濃度在0.01～0.03 mol/L范圍內(nèi)對野生櫻桃李花色苷的輔色度最大，其中草酸的輔色作用最強，甘氨酸具有減色作用。野生櫻桃李花色苷經(jīng)草酸、丙二酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、丁二酸輔色處理后的熱穩(wěn)定性有不同程度的提高。葡萄糖、果糖、蔗糖對野生櫻桃李花色苷的輔色作用不明顯。在與氧化劑亞硝酸鈉共存條件下，蔗糖明顯表現(xiàn)出抑制亞硝酸鈉對花色苷的氧化降解作用。

天然色素富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對人體無毒副作用，具有一定的保健功能，作為著色劑，也有良好的著色效果。但在應用過程中，天然色素穩(wěn)定性受到很多因素的影響。本試驗初步討論了7種有機酸和3種糖對野生櫻桃李色素的輔色作用，研究結(jié)果為野生櫻桃李色素的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。