張婷婷 王先火 孟斌 任秀寶 張會(huì)來(lái)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常見(jiàn)的類型，在臨床表現(xiàn)、免疫表型和分子遺傳學(xué)等方面具有高度異質(zhì)性［1］。腺苷信號(hào)通路是近年來(lái)被證實(shí)的一種新型免疫逃逸機(jī)制。腫瘤細(xì)胞在乏氧條件下釋放核苷酸，核苷酸進(jìn)一步由CD39/CD73水解為腺苷，游離腺苷與4個(gè)不同的G蛋白偶聯(lián)受體（A1、A2A、A2B和A3）結(jié)合發(fā)揮廣泛的免疫抑制作用，其中A2aR因其高親和力和廣泛表達(dá)而受到關(guān)注［2］。研究表明，阻斷A2aR可增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的活性，提高抗腫瘤免疫反應(yīng)［3-4］。腫瘤源性的腺苷和抗腫瘤T細(xì)胞上A2aR表達(dá)參與多種腫瘤化療及免疫治療的耐藥［5-6］。目前，僅有少數(shù)研究報(bào)道A2aR在實(shí)體瘤中的表達(dá)及意義［3，7］，尚未見(jiàn)血液腫瘤中A2aR表達(dá)和臨床意義的研究。本研究旨在探索DLBCL中A2aR總表達(dá)和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)與患者臨床病理特征、預(yù)后之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究DLBCL多重免疫逃逸機(jī)制和免疫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2010年1月1日至2015年12月31日就診于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院初治的72例DLBCL患者石蠟組織和臨床病理資料。所有患者均接受2個(gè)周期及2個(gè)周期以上類RCHOP方案治療?；颊吣挲g為17～84歲，平均年齡為（52.5±14.2）歲；其中男性39例（54.2%），女性33例（45.8%）；生發(fā)中心B細(xì)胞（germinal center B cell，GCB）亞型31例（43.1%），非生發(fā)中心B細(xì)胞（nongerminal center B cell，non-GCB）亞型35例（48.6%），未分類6例（8.3%）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 石蠟組織4 μm切片，采用多重免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DLBCL組織中A2aR、CD8的表達(dá)。兔抗人A2aR、CD8多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Opal多染試劑、HRP兔二抗、blocking buffer均購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)原理 多重免疫組織化學(xué)技術(shù)是在原免疫組織化學(xué)基礎(chǔ)上，采用二抗上帶有的HRP催化加入體系的非活性熒光素，熒光素在HRP和過(guò)氧化氫的作用下被活化，跟臨近目的蛋白上的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波處理，非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素還留存在樣品上（熒光素不受微波處理影響，并能在抗體去除后保留信號(hào)），微波處理之后可進(jìn)行下一個(gè)蛋白的染色。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟 取新鮮標(biāo)本，10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片；將組織切片放置在70℃恒溫箱中烘烤2 h，二甲苯、梯度乙醇浸片；將玻片浸泡于250 mL抗原修復(fù)液中，置于微波爐中（高火至液體沸騰，調(diào)至低火，維持15 min），室溫自然冷卻；滴加blocking buffer，保濕孵育10 min；滴加CD8抗體（稀釋濃度1∶1 000），4℃冰箱過(guò)夜；滴加HRP兔二抗，保濕孵育10 min；滴加opal 520，保濕孵育10 min，TBST沖洗玻片；將玻片浸泡于250 mL抗原修復(fù)液中，置于微波爐中，重復(fù)上述步驟，滴加A2aR抗體（稀釋濃度1∶3 500）、HRP兔二抗、opal 620；滴加DAPI、封片。

1.2.4 結(jié)果判讀 采用Mantra成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，每張切片采集20個(gè)200倍視野。應(yīng)用Inform軟件進(jìn)行蛋白定量、定位分析。A2aR陽(yáng)性定義為≥1%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜著色。

1.3 隨訪

通過(guò)查閱門(mén)診、住院病歷及電話進(jìn)行隨訪，隨訪日期截至2017年4月。所有患者均獲得隨訪，中位隨訪時(shí)間為35（4～83）個(gè)月。預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)為OS，定義為確診至患者死亡（完全數(shù)據(jù)）或末次隨訪的時(shí)間（截止數(shù)據(jù)）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。A2aR表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL組織及CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)

72例DLBCL患者中，A2aR總表達(dá)陽(yáng)性率為41.7%（30/72），陰性率為58.3%（42/72），A2aR陽(yáng)性和陰性表達(dá)的比較見(jiàn)圖1。CD8+患者有58例，其中CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)陽(yáng)性率為27.6%（16/58），CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)陰性率為72.4%（42/58），CD8+T細(xì)胞上A2aR的表達(dá)見(jiàn)圖2。

2.2 A2aR總表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，A2aR總表達(dá)與患者分期、IPI評(píng)分、Ki-67、β2-MG、B癥狀相關(guān)（P＜0.05，表1）。

2.3 CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)與患者分期、結(jié)外受累數(shù)目、IPI評(píng)分、Ki-67、β2-MG、B癥狀、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）相關(guān)（P＜0.05，表2）。

2.4 A2aR總表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，A2aR陽(yáng)性組患者OS較陰性組較差（P＜0.05，圖3）。A2aR陽(yáng)性組患者中位OS（median OS，mOS）為53.5（95%CI：41.4～65.5）個(gè)月，而A2aR陰性組患者mOS為69.0（95%CI：60.9～77.1）個(gè)月。隨訪期間，A2aR陰性組8例（19.0%）死亡，A2aR陽(yáng)性組13例（43.3%）死亡。

圖1 A2aR染色結(jié)果（×200）

圖2 CD8+T細(xì)胞上A2aR的表達(dá)

2.5 CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，CD8+T細(xì)胞上A2aR陽(yáng)性組患者OS較陰性組顯著更差（P＜0.001），且生存曲線比定位A2aR總表達(dá)患者生存曲線分離更加明顯（圖4）。A2aR陽(yáng)性組患者mOS為34.8（95%CI：22.2～47.5）個(gè)月，而A2aR陰性組患者mOS為76.2（95%CI：69.8～82.5）個(gè)月。隨訪期間，A2aR陰性組中4例（9.5%）死亡，A2aR陽(yáng)性組中11例（68.8%）死亡。

表1 A2aR總表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

表1 A2aR總表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 （續(xù)表1）

表2 CD8+T細(xì)胞上A2AR表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

圖3 A2aR總表達(dá)與患者總生存期之間的關(guān)系

圖4 CD8+T細(xì)胞上A2AR表達(dá)與患者總生存期之間的關(guān)系

3 討論

A2aR屬于新型第二代免疫檢查點(diǎn)分子，是腫瘤微環(huán)境CD8+T細(xì)胞表面主要的免疫檢查點(diǎn)受體之一，可抑制T細(xì)胞上TCR誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路，抑制IL-2、IL-4、IFN-γ分泌，從而誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞功能失活［5］。A2aR上調(diào)T細(xì)胞表面其他免疫檢查點(diǎn)，如PD-1、LAG-3等［8］表達(dá)，共同介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。此外，A2aR在腫瘤微環(huán)境其他免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均有表達(dá)，通過(guò)多種途徑發(fā)揮協(xié)同免疫抑制作用［2］。目前，關(guān)于A2aR蛋白在腫瘤中的表達(dá)及臨床意義研究較少。Ma等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中A2aR表達(dá)與患者病理分級(jí)、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明A2aR表達(dá)水平與頭頸鱗狀細(xì)胞癌惡性程度密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，A2aR表達(dá)與患者性別、吸煙、病理分類相關(guān)，A2aR表達(dá)越高，患者預(yù)后越好，目前尚無(wú)解釋［7］。A2aR在不同腫瘤中表達(dá)及預(yù)后價(jià)值并不相同。本研究分析了A2aR在DLBCL中表達(dá)情況和臨床病理特征之間的關(guān)系。A2aR總表達(dá)與患者分期、IPI評(píng)分、Ki-67、β2-MG相關(guān)；A2aR+組患者OS較A2aR-組患者差，表明A2aR可能是DLBCL患者不良預(yù)后因素之一。CD8+T細(xì)胞作為腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中效應(yīng)毒性T細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用［9］。T細(xì)胞表面多重免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)可通過(guò)不同信號(hào)通路抑制T細(xì)胞活性，進(jìn)而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)［10］。本研究分析了CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。A2aR+CD8+與患者分期、IPI評(píng)分、β2-MG、Ki-67、LDH、結(jié)外受累數(shù)目、B癥狀相關(guān)，A2aR+CD8+組患者OS較A2aR-CD8+組患者更差。相比A2aR總表達(dá)，定位CD8+T細(xì)胞上A2aR表達(dá)可更好地評(píng)價(jià)DLBCL患者的預(yù)后。

綜上所述，A2aR的免疫治療已顯示出潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。A2aR抗體（PBF-509）聯(lián)合PD-1抗體治療非小細(xì)胞肺癌的臨床Ⅰ/Ⅰb期試驗(yàn)（NCT02403193）正在開(kāi)展。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合A2aR抗體可以降低免疫相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生頻率［2］。A2aR有可能成為DLBCL淋巴瘤中新的免疫治療靶點(diǎn)，并有望聯(lián)合其他免疫檢查點(diǎn)抗體應(yīng)用于臨床，從而進(jìn)一步提高患者的療效。