馬文靜， 趙 穎， 魏小紅， 曹 麗

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

露蕊烏頭(Aconitumgymnandrum)是毛茛科烏頭屬露蕊烏頭亞屬的唯一物種[1]，海拔2 000 m以上的高山地區(qū)均有分布，尤其是在棄耕地或退化草地中經(jīng)常有較大居群[2]。一方面露蕊烏頭具有重要的藥用價(jià)值，露蕊烏頭與川烏、草烏等名貴中藥材親緣關(guān)系接近，其葉、花和根皆可入藥，具祛風(fēng)鎮(zhèn)靜、驅(qū)蟲殺蛆的功效，也可用于治療關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕等病癥[3]。另一方面露蕊烏頭的花顏色鮮艷，也具有一定的觀賞價(jià)值。但多年來對(duì)露蕊烏頭系統(tǒng)的研究和開發(fā)利用一直很少，因此研究露蕊烏頭具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

在種子休眠和萌發(fā)過程中，激素占據(jù)重要的位置，他們能通過信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)種子內(nèi)各種生理變化做出反應(yīng)，調(diào)節(jié)一系列蛋白質(zhì)、酶的代謝，從而調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)[4]。赤霉素(gibberellin acid, GA3)能顯著促進(jìn)種子的萌發(fā)，GA3在促進(jìn)種子萌發(fā)中至少起到兩種作用：一是軟化種胚周圍的組織，克服種皮機(jī)械限制；二是促進(jìn)種胚的生長(zhǎng)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)GA3能顯著提高白背紫斑杜鵑和三花杜鵑的發(fā)芽率(germination percentage, GP)，發(fā)芽勢(shì)( germination energy, GE)以及發(fā)芽指數(shù)(germination index, GI)[7]，GA3能夠促進(jìn)流動(dòng)沙丘先鋒植物沙米種子的萌發(fā)[8]。此外，王立輝等人研究船盔烏頭種子萌發(fā)的適宜溫度為15℃～25℃，最適溫度為25℃[9]。用200、600、1 000 mg·L-1的GA3浸種處理12 h可使短尾越橘的發(fā)芽率分別提高到60%、65%和64%[10]。用100、250、500 mg·L-1的GA3浸種處理可極顯著提高烏飯樹種子的發(fā)芽率，發(fā)芽勢(shì)及活力指數(shù)(vigor index, VI)[11]。綜上所述，本研究細(xì)化GA3濃度設(shè)置：0、125、250、500、750、1 000、1 500 mg·L-1GA3，設(shè)置了18℃(12 h)、25℃(12 h)變溫培養(yǎng)，探究不同濃度 GA3浸種處理對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)的影響。

種子萌發(fā)是植物建苗的關(guān)鍵階段。露蕊烏頭種子的萌發(fā)率極低，嚴(yán)重限制了露蕊烏頭的開發(fā)利用[12]。目前外源GA3已廣泛應(yīng)用于促進(jìn)種子萌發(fā)，但是使用外源GA3促進(jìn)露蕊烏頭種子萌發(fā)方面的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過外源GA3處理露蕊烏頭種子對(duì)萌發(fā)期的碳水化合物含量、水解酶及抗氧化酶活性動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，探討露蕊烏頭種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)條件及GA3濃度，明晰外源GA3促進(jìn)露蕊烏頭種子萌發(fā)的生理機(jī)制，旨在為破除露蕊烏頭種子休眠及其人工栽培提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料為露蕊烏頭種子，采于海拔2 960～2 970 m的甘肅省天祝草原(東經(jīng)102°84′， 北緯37°24′)。在露蕊烏頭的植株上直接采集，后將種子風(fēng)干，人工去掉果殼，在低溫、干燥的環(huán)境下保存，備用。

本試驗(yàn)挑選大小一致、飽滿的露蕊烏頭種子，先用5%的次氯酸鈉溶液消毒滅菌5～10 min，然后用蒸餾水沖洗3～5次。將露蕊烏頭種子在0、125、250、500、750、1 000、1 500 mg·L-1GA3溶液中浸泡24 h，然后置于墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中(φ=9 cm)，每皿放置100粒，每個(gè)處理重復(fù)6次。將所有培養(yǎng)皿分別置于A：光照強(qiáng)度3 000 Lx，培養(yǎng)溫度25℃(12 h)/18℃(12 h)，B：完全黑暗，培養(yǎng)溫度25℃(12 h)/18℃(12 h)兩個(gè)條件下培養(yǎng)[13]，共培養(yǎng)8 d。以種子露白作為萌發(fā)標(biāo)志，每天記錄各皿中發(fā)芽的種子數(shù)，共統(tǒng)計(jì)8 d。試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算發(fā)芽率，發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，分別于第1，3，6天測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1種子發(fā)芽指標(biāo) 發(fā)芽率(GP)= 8 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%[14]

發(fā)芽勢(shì)(GE) = 5 d內(nèi)發(fā)芽的種子粒數(shù)/供發(fā)芽種子粒數(shù)×100%[15-16]

發(fā)芽指數(shù)(GI)= ∑(Gt/Dt)。其中Gt為8 d的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日[17]

活力指數(shù)(VI) = 發(fā)芽指數(shù)×幼苗平均鮮重[18]

1.2.2生理指標(biāo)測(cè)定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定；α-淀粉酶活力采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定；蛋白酶活性采用酪氨酸法測(cè)定；脂肪酶活性采用底物乳化法測(cè)定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)采用NBT顯色法測(cè)定；過氧化物酶(peroxidase, POD)采用愈創(chuàng)木酚氧化法測(cè)定；過氧化氫酶(catalase, CAT)采用紫外吸收法測(cè)定[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制，用Duncan進(jìn)行多重比較分析差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照及黑暗條件下GA3浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)的影響

由表1和2可知，在光照和黑暗條件下，在0～1 000 mg·L-1GA3范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的升高，露蕊烏頭種子的發(fā)芽率(GP)、發(fā)芽勢(shì)(GE)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)(VI)呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢(shì)。當(dāng)GA3濃度為1 000 mg· L-1時(shí)發(fā)芽率達(dá)到最大值，分別為91.66%和95.67%。與光照相比，黑暗處理下露蕊烏頭種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別提高4.37%，72.19%，26.58%和32.60%。綜上，黑暗條件下1 000 mg·L-1GA3浸種是促進(jìn)露蕊烏頭種子萌發(fā)的最佳條件。

表1 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子在光照條件下萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of GA3 on seed germinations of Aconitum gymnandrum in illumination

注：同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: The data indicates mean ±SD. Different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level, and different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level

表2 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子在黑暗條件下萌發(fā)率的影響Table 2 Effects of GA3 on seed germination s of Aconitum gymnandrum in dark

2.2 黑暗條件下1 000 mg·L-1 GA3浸種處理對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)中主要物質(zhì)及相關(guān)酶的影響

2.2.1濃度為1 000 mg·L-1GA3浸種處理對(duì)露蕊烏頭種子可溶性糖、可溶性蛋白的影響 由圖1可知，萌發(fā)第1天，GA3處理與對(duì)照種子的可溶性糖含量沒有顯著差異(P<0.05)，與對(duì)照相比，萌發(fā)第3、6天，GA3處理下種子內(nèi)可溶性糖含量分別下降11.53%，33.33%。

由圖2可知，與CK處理相比，萌發(fā)第1、3天，1 000 mg·L-1GA3處理露蕊烏頭種子內(nèi)可溶性蛋白含量均無顯著變化(P<0.05)。萌發(fā)第6天，1 000 mg·L-1GA3處理的種子的可溶性蛋白含量比對(duì)照提高28.30%。1 000 mg·L-1GA3處理與CK處理種子內(nèi)可溶性蛋白含量均在第6天達(dá)到最大值，相比第3天分別提高了78.95%和53.18%。

圖1 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的影響Fig.1 Influences of GA3 on soluble sugar contents in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

圖2 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Influences of GA3 on soluble protein contents in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

2.2.2濃度為1000mg·L-1GA3浸種處理對(duì)露蕊烏頭種子α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性的影響 由圖3可知，與CK處理相比，萌發(fā)第1、3、6天，1 000 mg·L-1GA3處理下露蕊烏頭種子α-淀粉酶活性分別提高了4.47%、30.56%、7.30%。在萌發(fā)過程中，對(duì)照組種子內(nèi)α-淀粉酶活性無顯著變化(P<0.05)，而GA3處理組α-淀粉酶活性在第3天達(dá)到最大值，并且在萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性均保持在較高水平。

圖3 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性的影響Fig.3 Influences of GA3 on α-amylase activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

如圖4所示，在萌發(fā)過程中，用GA3處理的露蕊烏頭種子內(nèi)蛋白酶活性始終高于CK處理。萌發(fā)第1天，與CK相比，1 000 mg·L-1GA3處理種子中蛋白酶活性無顯著變化(P<0.05)。萌發(fā)第3、6天，GA3處理露蕊烏頭種子內(nèi)蛋白酶活性分別比CK提高了48.78%，70%。

圖4 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)過程中蛋白酶活性的影響Fig.4 Influences of GA3 on proteinase activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

如圖5可知，萌發(fā)第1天，GA3處理種子中脂肪酶活性比CK下降了10.87%。萌發(fā)第3天，經(jīng)GA3處理的種子脂肪酶活性達(dá)到最大值，相比CK提高了48.8%，在處理的第6天，GA3處理種子內(nèi)的脂肪酶活性比對(duì)照提高了17.65%。

圖5 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)過程中脂肪酶活性的影響Fig.5 Influences of GA3 on lipase activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

2.3 黑暗條件下1 000 mg·L-1GA3浸種處理對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)中抗氧化酶活性的影響

由圖6所示，隨發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，經(jīng)1 000 mg·L-1GA3處理的種子SOD活性始終高于CK組。在處理的第1、3、6天，GA3處理的種子內(nèi)SOD的活性分別比CK提高了6.48%，9.68%，32.67%。

圖6 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)過程中超氧化物歧化酶活性的影響Fig.6 Influences of GA3 on SOD activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

由圖7所示，處理第1天，GA3和CK處理下露蕊烏頭種子內(nèi)POD活性無顯著性差異(P<0.05)。處理第3、6天，GA3處理下POD活性分別比對(duì)照提高了102.80%和24.65%。第6天與第1天相比，經(jīng)1 000 mg·L-1GA3處理的種子的POD活性顯著提高了160.97%(P<0.05)，CK處理組則提高了119.39%，GA3處理顯著增強(qiáng)露蕊烏頭種子內(nèi)POD的活性(P<0.05)。

圖7 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)過程中過氧化物酶活性的影響Fig.7 Influences of GA3 on POD activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

由圖8可知，在萌發(fā)第1天，經(jīng)1 000 mg·L-1GA3與蒸餾水(CK)處理的種子CAT活性無顯著差異(P<0.05)。處理第3天，GA3處理露蕊烏頭種子內(nèi)CAT活性比CK處理提高了30.88%。處理第6天，GA3處理種子內(nèi)CAT活性比CK處理下降45.57%。

圖8 GA3溶液浸種對(duì)露蕊烏頭種子萌發(fā)過程中過氧化氫酶活性的影響Fig.8 Influences of GA3 on CAT activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

3 討論

3.1 外源GA3作用下露蕊烏頭種子的萌發(fā)

種子萌發(fā)是植物生活史的重要階段，植物種子能對(duì)適宜萌發(fā)的外界條件做出反應(yīng)，及時(shí)萌發(fā)并建苗以避開不利于幼苗生長(zhǎng)與存活的惡劣環(huán)境，從而提高植物的整體適合度[20]，因此人為設(shè)置適宜的外界條件可以有效促進(jìn)種子的萌發(fā)。GA3作為一種信號(hào)物質(zhì)，在促進(jìn)種子萌發(fā)的過程中發(fā)揮著重要的作用。周麗霞、李赫男等人對(duì)紫花高烏頭和黃花烏頭種子的研究表明不同濃度的GA3處理對(duì)烏頭種子萌發(fā)的促進(jìn)效果不同[21-22]。李開祥等研究表明GA3可以促進(jìn)肉桂種子的萌發(fā)[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0、125、250、500、750、1 000、1 500 mg·L-1不同濃度梯度的GA3處理露蕊烏頭種子后均可以提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，其中以1 000 mg·L-1的GA3處理結(jié)果最為明顯。此外，黑暗處理下的露蕊烏頭的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均高于光照處理組。說明黑暗條件下培養(yǎng)，1 000 mg· L-1GA3浸種是促進(jìn)露蕊烏頭種子的萌發(fā)的最佳條件。

3.2 外源GA3作用下對(duì)露蕊烏頭種子主要物質(zhì)及相關(guān)酶的影響

種子成熟的過程中會(huì)積累大量的可溶性糖、可溶性蛋白等貯藏物質(zhì)，當(dāng)種子打破休眠進(jìn)入萌動(dòng)狀態(tài)時(shí)，首先動(dòng)用胚部或胚中軸的可溶性糖及貯藏蛋白。吳玉香等研究表明GA3使西洋杜鵑中的可溶性糖、可溶性蛋白發(fā)生不同的變化[24]。黃珍等人研究表明GA3處理使得華重樓種子可溶性糖呈下降趨勢(shì)[25]。胥學(xué)峰研究表明用GA3處理黃芪后的可溶性蛋白含量呈先下降后上升的趨勢(shì)[26]。本研究表明1 000 mg·L-1GA3處理后的露蕊烏頭種子萌發(fā)中可溶性糖和可溶性蛋白的變化情況均比CK處理的種子變化顯著。在萌發(fā)過程中，與對(duì)照相比，GA3浸種促進(jìn)了露蕊烏頭種子內(nèi)可溶性糖的水解，為種子萌發(fā)提供動(dòng)力。1 000 mg·L-1GA3處理露蕊烏頭種子內(nèi)可溶性蛋白的含量先下降后上升，萌發(fā)前期可溶性蛋白水解為其他物質(zhì)為種子的萌發(fā)提供能量；萌發(fā)后期可溶性蛋白含量上升這可能與露蕊烏頭種子內(nèi)相關(guān)代謝酶的積累變化有關(guān)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)代謝酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。綜上所述，GA3處理促進(jìn)了露蕊烏頭種子中可溶性糖的水解和可溶性蛋白的水解再合成，從而為種子打破休眠提供足夠的動(dòng)力。

種子萌發(fā)過程中，貯藏于其組織中的大分子物質(zhì)在相關(guān)代謝酶類(α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等)的催化作用下被分解成可溶性的小分子物質(zhì)，隨后運(yùn)送到胚的生長(zhǎng)部位被繼續(xù)的分解和利用。魚小軍等人研究表明外源GA3提高了條葉車前種子的α-淀粉酶的活性從而促進(jìn)了種子的萌發(fā)[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論與其基本一致。結(jié)果表明GA3提高了α-淀粉酶的活性，α-淀粉酶可以促進(jìn)了種子內(nèi)淀粉的水解，淀粉僅作為一種暫時(shí)的貯藏物質(zhì)，不斷的水解為可溶性糖以滿足種子萌發(fā)生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，萌發(fā)第6天，可溶性糖的積累已經(jīng)足夠并一直處于水解狀態(tài)，使得淀粉酶的活性降低。在萌發(fā)過程中，GA3處理和CK中蛋白酶活性都降低，但相比對(duì)照而言，GA3提高了蛋白酶的活性，可以促進(jìn)可溶性蛋白水解為氨基酸，水解后的氨基酸可以重新合成其他蛋白質(zhì)。GA3促進(jìn)蛋白質(zhì)的新陳代謝，這和本研究中可溶性蛋白含量的變化相一致。與CK處理相比，GA3處理提高了露蕊烏頭種子內(nèi)脂肪酶活性，促使種子內(nèi)部貯藏物質(zhì)大量分解，然后將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送到各器官供生長(zhǎng)使用，從而促進(jìn)露蕊烏頭種子打破休眠狀態(tài)繼而進(jìn)入萌發(fā)狀態(tài)。

3.3 外源GA3作用下露蕊烏頭種子抗氧化酶活性的變化

4 結(jié)論

本文研究表明，在光照和黑暗條件下，適宜濃度的GA3浸種均可以提高露蕊烏頭種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，其中黑暗條件下培養(yǎng)，1 000 mg·L-1GA3浸種是促進(jìn)露蕊烏頭種子萌發(fā)的最佳條件。 通過測(cè)定1 000 mg·L-1GA3浸種處理后種子萌發(fā)期生理指標(biāo)，進(jìn)一步探索了其萌發(fā)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)GA3可以通過改變露蕊烏頭種子內(nèi)可溶性糖及可溶性蛋白的含量，提高相關(guān)水解酶及抗氧化酶的活性來促進(jìn)種子萌發(fā)?？傊?，黑暗條件下培養(yǎng)，1 000 mg·L-1GA3浸種可用于實(shí)際生產(chǎn)中促進(jìn)露蕊烏頭種子的萌發(fā)。