張曉艷 李炳蔚 尚 飛 劉明明 劉淑英 盛有明 李宏偉 修瑞娟

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院 微循環(huán)研究所 衛(wèi)生部微循環(huán)重點實驗室（北京 100005）

由高脂飲食誘導的男性生精功能障礙受到廣泛關(guān)注[1-5]。有文獻報道，長期高脂飲食可誘導小鼠睪丸內(nèi)炎癥細胞因子表達增高[6]，但高脂飲食對睪丸微血管的影響，以及睪丸微血管功能與高脂誘導的睪丸內(nèi)炎癥反應的關(guān)系，報道較少。本研究利用高脂飲食建立C57BL/6雄性肥胖小鼠模型，觀察由高脂飲食誘導的小鼠睪丸微血管病理生理改變與炎癥細胞在睪丸組織的浸潤以及生精細胞組織結(jié)構(gòu)病理變化的關(guān)系，為進一步探索高脂飲食誘導的雄性生殖功能損害機制提供依據(jù)。

材料與方法

一、儀器設(shè)備及主要試劑

羅氏血糖儀及配套血糖試紙（德國羅氏公司）；激光多普勒血流灌注監(jiān)測系統(tǒng)（Moor VMS-LDF，英國Moor公司產(chǎn)品）；石蠟切片機（RM2245，德國Leica公司產(chǎn)品）?？勾笫驝D31、F4/80單克隆抗體、山羊抗小鼠腫瘤壞死因子單克隆抗體（TNFα）及TNFα和MCP-1ELISA檢測試劑盒購于英國Abcam公司；TUNEL細胞原位凋亡檢測試劑盒（美國Roche公司）；檸檬酸緩沖液（北京康為世紀公司）；高脂飼料（D12492，為國際通用高脂飼料配方）及普通繁殖飼料均購自中國醫(yī)學科學院動物研究所華阜康生物科技有限公司。

二、實驗動物

本研究動物實驗經(jīng)中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院微循環(huán)研究所倫理委員會批準。SPF級7～8周雄性C57BL/6小鼠40只，質(zhì)量23～25g，購自中國醫(yī)學科學院動物研究所[SCXK(京)2009-0007]。經(jīng)過1周適應性喂養(yǎng)，隨機分為對照組（Control, n=20）和高脂組（High fat diet, HFD, n=20）。對照組飼料為普通繁殖飼料，高脂組為高脂飼料（D12492，其中脂肪供能60%，碳水化合物供能20%,蛋白質(zhì)供能20%）。兩組動物自由飲水取食，飼養(yǎng)于12 h明暗交替環(huán)境中，溫度22～23℃，濕度40%～60%，每周監(jiān)測體質(zhì)量和血糖。于喂養(yǎng)20周末，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。以激光多普勒血流灌注監(jiān)測系統(tǒng)檢測睪丸血流灌注量，后留取全血樣本。下腹部十字切口取兩只睪丸，稱量后分別于10%中性甲醛固定，置于凍存管中液氮速凍。

三、方法

（一） HE染色觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)變化

睪丸固定于中性甲醛8 h后，用5號針頭分別于睪丸兩端刺穿白膜（以利于固定液滲透于睪丸內(nèi)部，避免由于組織固定不良而導致染色信息不完整）。睪丸組織經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋后以5μm厚度切片。切片經(jīng)脫蠟水化后行伊紅染色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察睪丸組織病理變化。

（二）免疫組化法分析睪丸組織CD31、F4/80及TNFα表達情況

睪丸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2孵育10min，雙蒸水沖洗浸泡5min，檸檬酸鹽微波爐抗原修復10 min，室溫下自然冷卻。根據(jù)免疫組化試劑盒滴加一抗孵育，加相應二抗，最后以DAB試劑盒顯色。陽性表達為棕黃色染色，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行累積吸光度分析抗原相對表達量。

（三）TUNEL染色法觀察小鼠睪丸生精細胞凋亡情況

睪丸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。切片置入pH6.0檸檬酸鹽抗原修復液中微波爐高溫加熱1min，迅速將切片移入20℃雙蒸水中冷卻，PBS浸洗。將適量TUNEL反應混合物滴加在切片上，濕盒內(nèi)37℃孵育60min，PBS浸洗3次。切片滴加3%H2O2室溫10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入適量辣根過氧化物酶標記的抗熒光素抗體，濕盒內(nèi)30min，PBS浸洗3次。加入DAB顯色液染色，凋亡生精細胞為棕色，自來水充分清洗玻片。蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，以中性樹膠封片。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行累積吸光度分析抗原相對表達量。

（四）ELISA定量檢測小鼠血及睪丸蛋白TNFα和MCP-1的表達水平

全血樣本于室溫冰塊上靜置1h，4℃ 3 000×g，15min離心，收集上清于-80℃保存待檢測。睪丸經(jīng)液氮速凍研磨粉碎。超聲勻漿，600×g、5min離心，取上清-80℃保存待檢測。根據(jù)ELISA檢測試劑盒的操作步驟定量檢測血及睪丸組織中TNFα和MCP-1細胞因子表達量。

（五）睪丸微循環(huán)血流灌注水平檢測

在造模結(jié)束當日以1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，并使其仰臥固定于掃描臺。酒精消毒腹部皮膚，切開下腹部，輕提附睪周圍白色脂肪暴露睪丸。應用Moor VMS - LDF VP4針式探針檢測小鼠睪丸微循環(huán)血流量。LDF監(jiān)測基帶帶寬15kHz，血流輸出量5V＝1000U，時間常數(shù)0.5s。單次掃描時間＞1.5min，時程約5min。通過Moor VMS PC 2.1軟件提取各時相的睪丸血流灌注水平（perfusion unit，PU），計算平均灌注量（PU/min）。

（六） 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、兩組小鼠體質(zhì)量及血糖比較

高脂組小鼠經(jīng)高脂飲食20周后，體質(zhì)量增加顯著（45.00±3.00）g，與對照組（32.50±1.88）g 相比有顯著性差異（P＜0.01）；高脂組空腹血糖（9.96±1.57）mmol/L，顯著高于對照組的（5.32±1.16）mmol/L（P＜0.01），見圖1。同時，對照組小鼠睪丸外觀飽滿，白膜質(zhì)地柔韌，針刺時無阻力感；高脂組睪丸外觀色澤暗淡，白膜質(zhì)地韌度增高，針頭較難刺入。

圖1 高脂組與對照組小鼠體質(zhì)量及血糖的變化

二、兩組小鼠睪丸形態(tài)學及生精細胞凋亡水平染色

對照組小鼠睪丸HE染色結(jié)果顯示，生精上皮結(jié)構(gòu)完整，各級生精細胞排列有序，睪丸間質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密。高脂組小鼠睪丸生精上皮結(jié)構(gòu)紊亂，生精細胞之間排列松散，成熟生精細胞減少，無可見長型精子，生精小管萎縮；睪丸間質(zhì)膨大，細胞增多。TUNEL染色結(jié)果顯示：對照組小鼠睪丸僅可見個別凋亡生精細胞，IA值為（0.92±0.07）×107；而高脂組可見各級生精細胞凋亡， 且凋亡顯著，IA值為（1.87±0.13）×107，顯著高于對照組（P＜0.01），且生精上皮有不同程度破壞，見圖2。

圖2 睪丸組織HE染色及生精細胞TUNEL表達水平 (×400, n=5)

三、兩組小鼠睪丸TNFα及F4/80表達水平

高脂組小鼠睪丸TNFα表達IA值為（5.95±0.14）×108顯著高于對照組[IA值為（0.57±0.05）×108]（P＜0.001），生精小管、睪丸間質(zhì)及微血管均有表達；高脂組睪丸間質(zhì)巨噬細胞表達IA值為（3.16±0.20）×107數(shù)量也顯著多于對照組IA值為（1.14 ± 0.13）×107（P＜0.01），主要分布在睪丸間質(zhì)微血管附近，見圖3。

四、血及睪丸組織中TNFα和MCP-1的含量

ELISA檢測結(jié)果顯示，高脂組血中及睪丸蛋白中TNFα（血對照組：796.00±165.00 pg/mL，高脂組：3900.00±236.00 pg/mL；睪丸勻漿control：1219.00±127.00 pg/mL，高脂組：9612.00±377 pg/mL）和MCP-1（血對照組：121.00±39.00 pg/mL，高脂組：490.00±53.00 pg/mL；睪丸勻漿對照組：129.00±29.00 pg/mL，高脂組：612.00±77.00 pg/mL）表達量均顯著高于對照組（P＜0.001），見圖4。

五、睪丸微血管內(nèi)皮細胞CD31表達水平以及微血管血流灌注水平

與對照組[IA值為（2.41±0.15）×107]相比，高脂組睪丸微血管內(nèi)皮細胞特異性標志物CD31免疫組化染色表達缺失[IA值為(1.24±0.13)×107]（P＜0.05）。激光多普勒血流灌注監(jiān)測系統(tǒng)顯示，高脂組睪丸微血管血流灌注水平降低（對照組：557.40±135.00PU/min vs 高脂組：95.48±38.35 PU/min，t =10.92， P＜0.001），見圖5。

圖3 睪丸組織TNFα及F4/80免疫組表達 (×400, n=5)

圖4 TNFα及MCP-1在血及睪丸蛋白中的表達量

圖5 小鼠睪丸微血管內(nèi)皮細胞CD31表達變化及微血管血流灌注水平(×400, n=5)

討 論

睪丸微循環(huán)參與維持睪丸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，是睪丸內(nèi)血液供應、物質(zhì)代謝等重要生命活動的場所[7]。微血管內(nèi)皮細胞是睪丸微血管的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有文獻報道，高脂飲食可誘導血管內(nèi)皮細胞損傷并進一步誘發(fā)血管性疾病[8]，但高脂飲食對睪丸微血管的影響罕見報道。為了解高脂飲食誘導的睪丸微血管變化，本研究進行了睪丸微血管免疫組化染色及睪丸微血管激光多普勒掃描檢測。結(jié)果顯示，高脂組睪丸微血管內(nèi)皮細胞CD31表達減少甚至缺失，睪丸微循環(huán)血流灌注水平降低，提示高脂組睪丸微血管受損。此外，本研究C57BL/6小鼠經(jīng)20周高脂飼養(yǎng)后，空腹血糖水平顯著高于對照組（P＜0.01）。常規(guī)組織學染色顯示，高脂組睪丸生精上皮出現(xiàn)空泡樣改變，成熟生精細胞減少，甚至無長形精子。TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂組各級生精細胞均有凋亡，提示高脂組生精上皮受損，生精細胞生成障礙。由于高血糖可致小鼠睪丸微循環(huán)受損并可間接誘導生精功能障礙[9]，因此本研究認為高脂飲食誘導小鼠血糖增高是高脂小鼠睪丸微血管損傷的促發(fā)因素之一。

以往的研究主要針對高脂飲食誘導氧化應激對男性生殖的不良影響[10]。而最近有學者提出男性肥胖閹割理論（GELDING theory of male hypogonadism）[11]，其關(guān)鍵論點在于：高脂飲食對男性生殖的損害是由于高脂飲食產(chǎn)生的腸源性內(nèi)毒素刺激并損傷血-腸黏膜屏障，內(nèi)毒素由腸道入血，使體內(nèi)相關(guān)免疫系統(tǒng)被激活，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，可直接或間接損傷男性生精功能。另有文獻報道，腸源性內(nèi)毒素血癥是高脂誘導的全身性炎癥反應的關(guān)鍵因素[12]?；谝陨夏c源性內(nèi)毒素理論，本研究推測，高脂飲食誘導小鼠血糖增高損傷睪丸微血管內(nèi)皮細胞，使睪丸微血管功能受損；由于睪丸微血管是血睪屏障的重要組成部分[13]，微血管損傷可能破壞血睪屏障完整性，使高脂誘導的內(nèi)毒素通過受損的血睪屏障進入生精小管并損傷生精細胞。因此下一階段，將完善高脂飲食誘導的體內(nèi)內(nèi)毒素表達水平測定及內(nèi)毒素對睪丸微血管內(nèi)皮細胞及生精細胞影響的相關(guān)研究，以進一步論證男性閹割理論中內(nèi)毒素對雄性生殖的影響。

內(nèi)毒素有效成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是體內(nèi)特異性炎癥受體（toll like receptors，TLRs）的配體[14]，LPS激活TLRs后活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB并激活下游與炎癥相關(guān)的基因分泌TNFα等一系列炎癥細胞因子[15-19]。最近也有文獻報道，高脂飲食可誘導發(fā)育前期肥胖大鼠睪丸內(nèi)炎癥細胞增多[20]，因此筆者檢測了小鼠血中及睪丸組織勻漿中炎癥因子TNFα和MCP-1 水平以及睪丸巨噬細胞特異性標志物F4/80的表達水平。結(jié)果顯示高脂組血中及睪丸組織勻漿中炎癥因子TNFα和MCP-1 水平均顯著增高。由此我們推測，由腸道入血的腸源性內(nèi)毒素進入睪丸微血管系統(tǒng)，激活了睪丸微血管內(nèi)皮細胞上與炎癥相關(guān)的TLRs受體分泌釋放TNFα、MCP-1等炎癥因子。由于TNFα在誘發(fā)局部炎癥反應及免疫調(diào)節(jié)方面具有重要的生物活性，能刺激微血管內(nèi)皮細胞等靶細胞再次合成和分泌炎癥因子[21]，可能進一步加劇了睪丸微血管內(nèi)皮細胞損傷。此外，TNFα、MCP-1等炎癥細胞因子可能通過損傷的微血管滲透或擴散進入睪丸生精小管或睪丸間質(zhì)，MCP-1可募集睪丸內(nèi)炎癥細胞[22]，使炎癥細胞在睪丸聚集并發(fā)生免疫炎性反應，形成非感染性睪丸炎[23]。本研究結(jié)果顯示，高脂組睪丸內(nèi)F4/80表達增多；巨噬細胞免疫炎性反應可繼續(xù)釋放炎癥細胞因子，又將加劇對生精細胞的損傷，可能最終致雄性不育[23]。

綜上所述，高脂飲食誘導肥胖小鼠血糖水平升高導致睪丸微血管損傷；由高脂飲食產(chǎn)生的腸源性內(nèi)毒素可能激活了睪丸微血管內(nèi)皮細胞上與炎癥相關(guān)的TLRs受體，釋放炎癥因子；炎癥細胞因子通過損傷的微血管內(nèi)皮細胞滲透進入睪丸實質(zhì)，募集炎癥細胞在睪丸間質(zhì)聚集，致睪丸內(nèi)發(fā)生非感染性炎癥反應，并再次釋放炎癥細胞因子，后者通過受損的血睪屏障進入生精小管，損傷生精細胞，最終引發(fā)雄性生殖功能障礙。通過糾正高脂飲食誘導的血糖增高對睪丸微血管的損傷，減輕睪丸內(nèi)非感染性炎癥反應，可能成為臨床針對高脂飲食誘導的男性生精功障礙的治療靶點之一。