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(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

土地鹽漬化是全球廣泛存在的問題。在世界范圍內(nèi)，鹽漬化土地面積以每年約106hm2的速度迅速增加。我國鹽堿地面積己達(dá)9.9×107hm2，且仍以驚人的速度增長[1-2]。鹽脅迫嚴(yán)重影響植物生長，在一些地區(qū)導(dǎo)致作物產(chǎn)量大幅下降[3]。長期以來人們對鹽脅迫下植物抗性生理進(jìn)行了深入研究，嘗試通過傳統(tǒng)育種方法和現(xiàn)代生物技術(shù)來提高作物耐鹽性，并取得一定的成果。

自然條件下，植物往往受到多種逆境的影響。當(dāng)植物同時(shí)遭受兩種以上的逆境因素脅迫時(shí)，所受到的傷害往往大于單一逆境。但是，如果逆境脅迫前后發(fā)生，植物在受到第一種不良環(huán)境影響后，能夠產(chǎn)生抵抗其他不良環(huán)境的能力，即植物對逆境脅迫存在交叉適應(yīng)[4]。如水分虧缺可增加常綠杜鵑[5]等植物的抗寒性；低溫預(yù)處理可以提高馬鈴薯對線蟲病害的抗性[6]，因此對植物進(jìn)行某種逆境脅迫的預(yù)處理可作為增強(qiáng)植物抗逆性的一種策略。同樣的，對植物應(yīng)用低溫[7]及NO[8]等預(yù)處理，也可以提高植物的耐鹽性，但是，有關(guān)干旱預(yù)處理是否能夠提高植物的耐鹽性的研究較少。

一年生黑麥草(LoliummultiflorumLam.)是禾本科黑麥草屬的一年生草本植物，是世界上廣泛栽培的優(yōu)質(zhì)牧草和草坪草。與大多數(shù)植物一樣，一年生黑麥草生長過程中會(huì)遭受多種逆境的脅迫。目前，關(guān)于一年生黑麥草在干旱、鹽漬等單一逆境下的抗性生理研究較多，但對于黑麥草對這兩種逆境產(chǎn)生的交叉適應(yīng)的報(bào)道較少。本試驗(yàn)旨在探究干旱處理是否能誘導(dǎo)一年生黑麥草對鹽脅迫的耐受性，利用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)模擬干旱對一年生黑麥草進(jìn)行單一的以及經(jīng)干旱預(yù)處理后的鹽脅迫和鹽旱復(fù)合脅迫，研究一年生黑麥草相應(yīng)抗性生理指標(biāo)的變化情況，討論干旱預(yù)處理影響耐鹽性的生理機(jī)制，從而為鹽漬化土地中一年生黑麥草的栽培管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)

試驗(yàn)于2017年3月16日在西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院進(jìn)行。供試的一年生黑麥草草種由阿里種業(yè)有限公司提供。

挑選飽滿且大小均一的種子，用15%H2O2浸種消毒10 min后，用蒸餾水沖洗4～5次，置于鋪有兩層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，于25℃光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待長出子葉后移至裝有石英砂的塑料花盆中(口徑92 mm，底徑62 mm，高120 mm)。移栽后，置于溫度22.5℃、光照強(qiáng)度5 000 lx、光照時(shí)長14 h的培養(yǎng)室內(nèi)。每天澆水，每隔兩天補(bǔ)充Hoagland營養(yǎng)液。待幼苗長至約25 cm左右時(shí)進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)材料處理

一年生黑麥草幼苗分為6組(每組5次重復(fù))并按照以下方式處理：

(1)對照組(CK)：澆水和營養(yǎng)液6 d；

(2)單一鹽處理組(2% NaCl)：澆水和營養(yǎng)液3 d后，進(jìn)行2%的NaCl脅迫處理3 d；

(3)5% 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)預(yù)處理組(5%PEG-NaCl)：5%PEG處理3 d后，進(jìn)行2%NaCl脅迫處理3 d；

(4)10% PEG預(yù)處理組(10% PEG-NaCl)：10%PEG處理3 d后，進(jìn)行2%NaCl脅迫處理3 d；

(5)5% PEG+2%鹽組(5% PEG+NaCl)：澆水和營養(yǎng)液3 d后，進(jìn)行5%PEG和2%NaCl同時(shí)處理3 d；

(6)10% PEG+2%鹽組(10% PEG+NaCl)：澆水和營養(yǎng)液3 d后，進(jìn)行10%PEG和2%NaCl同時(shí)處理3 d。

處理完成后刈割植株的地上部分進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測定。

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)和測定方法

1.3.1相對含水量的測定 取黑麥草鮮樣在萬分之一天平上進(jìn)行第一次稱重(M1)，再將樣品浸入蒸餾水中24 h并稱其飽和重(M2)，隨后在烘箱內(nèi)105℃殺青30 min后，然后在75℃烘干至恒重(M2)。相對含水量(%) = (M1- M3)/ (M2- M3) ×100%。

1.3.2葉綠素含量的測定 采用80%丙酮提取葉綠素[9]。后用紫外可見分光光度計(jì)(UV-6100S型，MAPADA,中國)在波長645 nm和663 nm下測定吸光度，利用公式：葉綠素含量(mg·g-1FW)= (20.29A645+ 8.05A663) ×Vt×n/(1000×FW)計(jì)算單位鮮重(fresh weight, FW)的總?cè)~綠素含量。其中Vt為提取液總體積(ml)，下同；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.3丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量的測定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法[9]。以0.5%TBA溶液為空白對照，測定450 nm、532 nm和600 nm處的吸光值，用公式：MDA(μmol·g-1FW)= [6.452×(A532- A600) - 0.559×A450] ×Vt/(Vs×FW)計(jì)算MDA含量。其中，Vs為測定所用提取液體積(ml)。

1.3.4鈉離子和鉀離子含量的測定 取黑麥草葉片鮮樣，用去離子水洗凈，烘干，取0.1 g烘干樣品，將樣品加入至消煮管中，再加入1 ml過氧化氫和5 ml硝酸，放在消煮爐上消煮至澄清。消煮后液體過濾進(jìn)100 ml容量瓶中，用超純水定容，用火焰光度計(jì)(M410，sherwood，英國)及原子吸收分光光度計(jì)(PinAAcle，PE公司，美國)分別測定鉀離子以及鈉離子的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值表示，利用SAS 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA方差分析，并使用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，圖表采用Excel進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 相對含水量

從圖1可以看出，與對照組相比，各處理組相對含水量均有不同程度的降低，其中2% NaCl處理和5% PEG預(yù)處理分別較對照組降低了0.21%和1.21%，差異未達(dá)顯著水平；而10% PEG處理較對照組減少了25.61%，差異顯著(P<0.05)；在PEG和NaCl同時(shí)脅迫下，黑麥草的相對含水量顯著低于對照組(P<0.05)，雖略高于10% PEG預(yù)處理組，但差異不顯著。

圖1 不同處理下一年生黑麥草的相對含水量Fig.1 Relative water content of annual ryegrass under different treatments注：不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)， 誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差，下同Note: Different letters indicate significant differences among treatments at the 0.05 level, error bars represent standard error, the same as below

2.2 葉綠素含量

對照組葉綠素含量為9.31 mg·g-1FW，2% NaCl組的葉綠素含量較對照組減少了2.67%。PEG和NaCl同時(shí)脅迫使葉綠素含量進(jìn)一步下降，其中，10% PEG+NaCl較對照組下降了19.99%(P<0.05)。經(jīng)PEG預(yù)處理后葉綠素含量有所增加，雖與對照組之間差異未達(dá)顯著水平，但5%PEG-NaCl組中的葉綠素含量顯著高于單一鹽脅迫組和同時(shí)脅迫處理組(P<0.05)(見圖2)。

2.3 MAD含量

各處理組MDA含量較對照組均有不同程度的升高，但差異不顯著。對照組MDA含量約為0.720 μmol·g-1FW，2%NaCl組與對照組相比增加了30.22%。5%PEG和10%PEG與鹽同時(shí)處理組中MDA含量分別為35.96%和39.53%，增幅最大。而5%PEG和10%PEG預(yù)處理組MDA含量增幅最小，僅比對照組增加了4.91%和8.75%。(圖3)

圖2 不同處理下一年生黑麥草的葉綠素含量Fig.2 Chlorophyll content of annual ryegrass under different treatments

圖3 不同處理下一年生黑麥草中MDA含量Fig.3 MDA content in annual ryegrass under different treatments

2.4 鉀離子、鈉離子含量及鈉鉀比

與對照組相比，除10% PEG預(yù)處理組中黑麥草K+含量顯著增加41.38%(P<0.05)外，其他處理組K+含量均無顯著變化(圖4A)；而Na+含量在各處理組均有顯著升高(P<0.05)，其中以2% NaCl處理增幅最大，與對照組相比Na+濃度提高了5.28倍，以5% PEG-NaCl組增幅最小(1.5倍)，其Na+含量顯著低于其他處理組(P<0.05)(圖4B)。

與對照組相比，各處理組Na+/K+均顯著增加，其變化趨勢與Na+含量的變化相似，以2% NaCl組增幅最大，而5% PEG-NaCl組增幅最小，其Na+/K+顯著低于2% NaCl組、10% PEG-NaCl組和5% PEG+NaCl組(P<0.05)，但與10% PEG+NaCl組間差異未達(dá)顯著水平(見圖4C)。

圖4 不同處理下一年生黑麥草的鉀離子含量(A)、 鈉離子含量(B)及鈉鉀比 (C)Fig.4 The potassium content (A), sodium content (B) and potassium ratio (C) of the annual ryegrass under different treatments

3 討論

鹽脅迫下植物生長受到抑制、多種生理生化過程發(fā)生變化，使植物正常發(fā)育受到干擾[10-11]。當(dāng)植物受到雙重脅迫時(shí)，其傷害更大[12]。本試驗(yàn)中，在單一鹽及鹽旱雙重脅迫下，植物的相對含水量下降、葉綠素含量減少，Na+離子、MDA含量增加，對一年生黑麥草造成了不良影響。但經(jīng)5% PEG預(yù)處理后，與單一鹽逆境相比，黑麥草通過增加葉綠素含量以及維持鈉離子鉀離子平衡，在整體上增強(qiáng)了耐鹽性，而10% PEG預(yù)處理對植物耐鹽性的影響不明顯。

土壤溶液的水勢低于植物細(xì)胞水勢是造成植物含水量下降的原因之一，使植物根系吸水困難，導(dǎo)致相對含水量降低[13]。PEG和NaCl均降低了溶液的水勢，使得黑麥草吸水困難，造成一定程度的失水(圖1)。試驗(yàn)中，5% PEG預(yù)處理組植物的含水量與NaCl單獨(dú)處理組相比無顯著差異，5% PEG預(yù)處理無法有效緩解鹽脅迫下黑麥草含水量的下降。

在鹽脅迫下，植物多種生理過程失調(diào)，如膜系統(tǒng)受損、有害物質(zhì)累積等[14]，會(huì)使植物體內(nèi)葉綠素酶活性增強(qiáng)[15]，過量的鹽離子會(huì)破壞類囊體結(jié)構(gòu)和色素蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性[16]，這些因素均會(huì)導(dǎo)致植物葉綠素的減少。在本試驗(yàn)中，PEG+NaCl組也表現(xiàn)出了葉綠素含量的顯著降低，其中10% PEG+NaCl組降幅最大。而5% PEG處理有效地緩解了鹽脅迫下植物葉綠素含量的下降，能在一定程度上增加植物對鹽分脅迫的耐受性，Ma[17]等人在對水稻的研究中也得到了相似的結(jié)果，可能因?yàn)?% PEG預(yù)處理有效阻止了鹽脅迫下植物體內(nèi)Na+含量的增加，減輕了Na+對植物光合系統(tǒng)的負(fù)面影響[18]。值得注意的是，5% PEG預(yù)處理組的葉綠素含量與對照相比略有升高，這可能是該處理組植物耐鹽性增加所誘導(dǎo)的對鹽脅迫的響應(yīng)，姚曉華等對青稞幼苗的研究也有著相似的結(jié)果[19]。

植物在受到逆境脅迫時(shí)會(huì)造成細(xì)胞膜脂過氧化并產(chǎn)生MDA，植物的MDA含量是衡量膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)，并能間接反映膜系統(tǒng)受傷害的情況。鹽脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除失調(diào)，活性氧增加，使膜脂過氧化產(chǎn)生MDA，膜系統(tǒng)的完整性遭到破壞，影響細(xì)胞膜的選擇透性，進(jìn)而對細(xì)胞造成不可逆的損傷，阻礙各種代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，各處理間MDA含量差異均不顯著，鹽脅迫下黑麥草MDA含量略有增加，而 PEG預(yù)處理降低了鹽脅迫下MDA含量，這與康建宏等[20]在玉米幼苗干旱預(yù)處理對逆境的交叉適應(yīng)中的研究結(jié)果相似，說明PEG預(yù)處理能夠減輕鹽脅迫下的活性氧對膜系統(tǒng)的破壞，維持細(xì)胞膜正常的結(jié)構(gòu)功能。大量研究已證明MDA含量的減少與細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶有關(guān)，梅映學(xué)等[21]在對水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過干旱預(yù)處理后植物細(xì)胞內(nèi)CAT，SOD，POD和APX等抗氧化酶活性升高，增強(qiáng)了抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧的能力，從而減少了膜脂過氧化程度，提高黑麥草的耐鹽能力。

在鹽脅迫下，通常涉及滲透脅迫和離子毒害，Na+是鹽漬化土壤中的主要毒性離子之一，高濃度Na+影響細(xì)胞膜的選擇透性，使細(xì)胞內(nèi)一些必需元素外滲，破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡[22]。Parida和Das[23]研究指出控制植物對Na+的吸收并阻止其向地上部分運(yùn)輸是植物耐鹽機(jī)制之一。試驗(yàn)中，PEG減少了Na+的毒害，其中，5% PEG的作用顯著大于10% PEG。在植物的耐鹽性中，K+在植物體和細(xì)胞水平上維持滲透平衡有著重要的作用，也是代謝過程中多種酶的激活劑，高濃度鹽誘導(dǎo)組織內(nèi)K+含量降低是造成鹽害的主要原因之一[24]。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)，植物遭受干旱脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)K+積累，如干旱脅迫引起甜菜幼葉內(nèi)K+含量增加[25]。本研究中，鹽脅迫對K+含量影響較小，經(jīng)PEG預(yù)處理后K+含量升高，但變化不顯著?？赡苡捎邴}處理時(shí)間較短，各處理組之間K+差異不明顯。此外，植物體內(nèi)Na+與K+的比例(Na+/K+)也影響著植物的生理過程，其中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較低的Na+/K+對維持多種酶促過程是至關(guān)重要的，本試驗(yàn)中5% PEG預(yù)處理能有效緩解鹽脅迫對Na+/K+的影響，10% PEG預(yù)處理也有一定的緩解作用，其中黑麥草對Na+吸收的控制起著重要作用，這與Cayuela等[26]對番茄的研究結(jié)果相似。

對于交叉適應(yīng)現(xiàn)象的機(jī)理，沒有統(tǒng)一的理論解釋。干旱預(yù)處理降低了鹽脅迫對植物的傷害，主要表現(xiàn)在降低離子毒害，干旱會(huì)增加植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，比如糖、脯氨酸等，導(dǎo)致滲透勢降低[27]，從而減少Na+的吸收；干旱也會(huì)增加抗氧化酶的活性，從而減少鹽脅迫下MDA的生成及葉綠素的分解[28]。而干旱本身對植物也會(huì)造成失水和MDA增加等傷害[29]，當(dāng)干旱高于一定程度時(shí)，其自身造成的傷害大于對鹽害所起的緩解作用，因此，本試驗(yàn)中5% PEG預(yù)處理的效果顯著優(yōu)于10% PEG。

4 結(jié)論

單一鹽和鹽旱雙重脅迫均對植物造成了傷害，而雙重逆境的傷害遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單一脅迫。但對于一年生黑麥草來說，干旱預(yù)處理可通過增加葉綠素含量、減少Na+含量以及維持Na+/K+平衡提高其抗鹽性。此外，干旱預(yù)處理也會(huì)降低植物的含水量，因此，在應(yīng)用干旱預(yù)處理時(shí)，需注意干旱持續(xù)的時(shí)間及程度；其次，本試驗(yàn)僅討論在短期鹽脅迫下PEG預(yù)處理對一年生黑麥草耐鹽性的影響，對于黑麥草在長期鹽脅迫的生理響應(yīng)還需要進(jìn)一步研究。