張偉珍，李應(yīng)德，閆智臣，段廷玉

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

自然界中的微生物可以和大多數(shù)的高等植物建立共生關(guān)系，形成結(jié)構(gòu)與功能各不相同的互惠共生體，構(gòu)成眾多互惠共生系統(tǒng)，其中菌根共生系統(tǒng)是最為普遍的植物-微生物共生體，也是近年來研究的熱點(diǎn)[1]。菌根(mycorrhiza)這一術(shù)語最早出現(xiàn)于1885年，是由德國植物生理學(xué)家和森林學(xué)家Frank提出的。根據(jù)其形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)特征，菌根主要分為三大類型[內(nèi)生菌根(endomycorrhizae)、外生菌根(ectomycorrhizae)和內(nèi)外兼生菌根],其中叢枝菌根(arbuscular mycorrhizas,AM)是內(nèi)生菌根的常見類型，在自然界中分布十分廣泛，幾乎遍布整個(gè)植物界，是自然生態(tài)環(huán)境中重要的組成部分[2]。

AM真菌屬球囊菌門(Glomeromycota)包含250多個(gè)種，可以與超過80%的陸生植物形成AM共生體[3]。由于AM真菌是專性活體營養(yǎng)型，為了維持自身生長并完成其生活史，AM真菌依賴于寄主植物為其提供的碳源。反過來，AM真菌可以促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)，特別是氮、磷、鉀等元素的吸收[4-8]。除此之外，AM真菌還能提高寄主植物對(duì)干旱、鹽堿、重金屬和滲透壓等逆性環(huán)境以及病原真菌、病原線蟲、害蟲和雜草等生物逆境的抵抗能力[9-13]。AM真菌提高宿主植物抗逆性的生理、生化作用機(jī)制已基本明確[14-16]。而近幾年國內(nèi)外學(xué)者專家專注于其在分子層面的研究并已取得較大進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)在AM真菌-植物共生體中，AM真菌可以特異性調(diào)控植物體內(nèi)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，從而改變植株的生理生化特征以及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力。如一些球囊菌門的真菌可以調(diào)節(jié)編碼水通道蛋白以及胚發(fā)育后期大量蛋白質(zhì)的基因，而這些基因都與植物組織維持體內(nèi)水分、抵御干旱脅迫息息相關(guān)[17-18]。但總體而言AM真菌-植物共生體的研究多偏重于生理學(xué)和生態(tài)學(xué)方面[19-20]，關(guān)于AM真菌遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究相對(duì)較少。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在各學(xué)科中的交叉應(yīng)用，AM真菌分子生物學(xué)的研究也日漸深入，在AM真菌的分子生物學(xué)鑒定及其檢測(cè)以及植物-微生物互作等研究方面取得了較大進(jìn)展，這與分子生物學(xué)技術(shù)如qPCR、RT-PCR、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE),高通量測(cè)序(high-throughput sequencing),擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP),mRNA差異顯示技術(shù)，DDRT-PCR技術(shù)等的應(yīng)用密不可分[21-22]。但與其他學(xué)科相比，菌根學(xué)在此方面的研究尚有差距。發(fā)揮分子生物學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，緊跟植物學(xué)、微生物學(xué)學(xué)科前沿，對(duì)于揭示和理解植物-微生物互作機(jī)理具有不可替代的作用，本文歸納了利用分子生物學(xué)技術(shù)，在AM真菌-植物共生體互作方面的研究進(jìn)展，以期為更深入開展相關(guān)研究提供參考。

1 AM真菌分類鑒定

AM真菌的分類鑒定是進(jìn)行其他相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)，對(duì)于認(rèn)識(shí)AM真菌及菌種資源保護(hù)具有重要的意義。在AM真菌的研究初期，研究者多是根據(jù)孢子形態(tài)、菌絲侵染和產(chǎn)孢方式等特征對(duì)AM真菌進(jìn)行分類鑒定[23-24]。但由于受多種因素如地理差異、宿主植物不同等的影響，同一種AM真菌的孢子形態(tài)特征可能會(huì)具有較大的差別，這就會(huì)給菌種鑒定工作帶來困難，在進(jìn)行分類時(shí)易產(chǎn)生混亂[25-27]。近年來，隨著當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在菌種鑒定及分類地位中逐步引入分子生物學(xué)研究方法，基于核酸分析，運(yùn)用分子鑒定技術(shù)對(duì)AM真菌進(jìn)行系統(tǒng)分類，使AM真菌的分類更具科學(xué)性和準(zhǔn)確性，推動(dòng)AM真菌群落研究及其自然分類系統(tǒng)的建立和完善[28-30]。目前，18S rDNA測(cè)序技術(shù)、rRNA核苷酸序列分析、ITS序列分析、DNA限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)均被廣泛用于叢枝菌根真菌的分類和鑒定工作中[31-33]。如Redecker等[31]結(jié)合PCR-ITS-RFLP技術(shù)，對(duì)Glomussinuosum和Sclerocystiscoremioides兩種AM真菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行分子發(fā)育分析。一般采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定AM真菌種類，是直接從樣品中提取DNA作為模板，采用AM真菌的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再通過電泳分離擴(kuò)增的片斷或者采用其他的分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)不同叢枝菌根真菌的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列比對(duì)，從而確定真菌種類(表1)。

2 宿主植物AM真菌檢測(cè)

AM真菌檢測(cè)的常規(guī)方法是基于形態(tài)學(xué)觀察，如采用曲利苯藍(lán)對(duì)被AM真菌侵染的植物組織進(jìn)行染色，觀測(cè)植物根皮層的叢枝(arbuscules)和泡囊(vesicles)結(jié)構(gòu)，從而檢測(cè)出AM真菌是否侵染寄主植物[37]。但AM真菌種類眾多，且具有一定的地域獨(dú)特性，所以在寄主植物根內(nèi)的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)及形態(tài)特征上存在很大差異[38-39]。另外，在實(shí)際研究工作中發(fā)現(xiàn)，一種AM真菌可以侵染多種植物并定殖于其根部，而同一種植物根系內(nèi)也可能同時(shí)存在多種AM真菌[40]。因此，當(dāng)幾種AM真菌同時(shí)感染同一植物根段時(shí)，要想采用這種傳統(tǒng)方法準(zhǔn)確檢測(cè)某一種具體的AM真菌對(duì)植物根系的侵染并不容易，這給有關(guān)研究工作帶來了極大困難。

表1 AM真菌的分類鑒定Table 1 AM fungi classification and identification

近年來，國內(nèi)外學(xué)者在利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)AM真菌對(duì)寄主植物的侵染方面取得了較大進(jìn)展。通過分析核糖體DNA序列，設(shè)計(jì)出了AM真菌種或?qū)偎降奶禺愋砸?，從而使?zhǔn)確檢測(cè)AM真菌得以實(shí)現(xiàn)[41-42]。這種方法主要是通過提取AM真菌定殖的植物根段或孢子內(nèi)的真菌DNA，運(yùn)用PCR技術(shù)和AM真菌特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而對(duì)AM真菌進(jìn)行特異性檢測(cè)[43-44]。經(jīng)多項(xiàng)試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)可以準(zhǔn)確、快速地實(shí)現(xiàn)AM真菌的檢測(cè)，根內(nèi)球囊霉(G.intraradices)是最常見的叢枝菌根真菌之一，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及自然土壤修復(fù)等方面。而從中分離的DAOM-197198作為一種商業(yè)接種物，具有極其重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是如何量化AM真菌模型的孢子，檢測(cè)是否準(zhǔn)確分離到DAOM-197198，一直以來是該研究領(lǐng)域未解的難題。Badri等[45]從14個(gè)完整的AM真菌線粒體基因組序列中，通過在單拷貝cox3-rnl基因區(qū)間設(shè)計(jì)的水解探針進(jìn)行qPCR檢測(cè)，并進(jìn)行了驗(yàn)證，準(zhǔn)確地量化了分離所得DAOM-197198的孢子。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR和qPCR進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果表明，引物特異性擴(kuò)增了分離的DAOM-197198，產(chǎn)生106 bp的PCR產(chǎn)物，平均每個(gè)孢子mt基因的拷貝數(shù)為3 172 (n=6)，這充分顯示了利用qPCR技術(shù)檢測(cè)AM真菌的準(zhǔn)確性、精確度及其重現(xiàn)性。qPCR作為一種新興的科學(xué)技術(shù)，如何將其發(fā)展成為一種經(jīng)過嚴(yán)格驗(yàn)證的質(zhì)量控制手段，從而可以保證實(shí)際的生產(chǎn)需求，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，是目前眾多學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究的最終目標(biāo)。

鄭世學(xué)等[46]運(yùn)用特異性分子探針和nested-PCR技術(shù)，從田間接種AM真菌摩西球囊霉(G.mosseae)和根內(nèi)球囊霉的玉米(Zeamays)根樣中提取DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，成功地從感染根段中檢測(cè)到了接種的AM真菌，證明摩西球囊霉和根內(nèi)球囊霉都可以侵染玉米根系。2004年在番茄(Lycopersiconesculentum)根系中同樣檢測(cè)到了這兩種AM真菌[47]。為了迅速而又準(zhǔn)確地探測(cè)到自然生態(tài)系統(tǒng)中的多種AM真菌對(duì)植物的侵染，董秀麗和趙斌[48]在研究中首次將多重PCR與嵌套PCR結(jié)合起來研究田間AM真菌區(qū)系，即在一個(gè)反應(yīng)體系中，同時(shí)加入多種AM真菌種水平上的特異性引物，用于探測(cè)自然界中多種不同植物的AM真菌區(qū)系，這種檢測(cè)方法具有高度敏感性，準(zhǔn)確率高達(dá)95%(表2)。

3 AM真菌群落多樣性

AM真菌是生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性的重要組分之一，具有十分豐富的物種多樣性、遺傳多樣性和功能多樣性。AM真菌屬球囊菌門，包括1個(gè)綱4個(gè)目13個(gè)科19個(gè)屬，這是目前最新的分類系統(tǒng)，由Redecker等[49]于2013年整理完善。

AM真菌生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，幾乎存在于自然界的各個(gè)生境中，種質(zhì)資源十分豐富[50-51]。其宿主范圍亦十分廣泛，絕大多數(shù)植物包括被子植物、裸子植物、蕨類、苔鮮等都可不同程度地被AM真菌侵染[52]，而寄主植物的多樣性在一定程度上決定了AM真菌的多樣性。了解AM真菌的多樣性不僅具有理論價(jià)值，而且有重要的經(jīng)濟(jì)意義。通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)AM真菌物種豐富度及生物多樣性，可以了解AM真菌群落組成結(jié)構(gòu)、多樣性及其種屬間的差異，掌握其在不同耕作土壤類型中的分布特點(diǎn)，篩選優(yōu)勢(shì)菌株，優(yōu)化菌根植物互利共生體系，為菌根技術(shù)的應(yīng)用準(zhǔn)備基礎(chǔ)菌種資源和技術(shù)基礎(chǔ)。目前，隨著分子生物學(xué)科的不斷完善，眾多分子生物學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用到AM真菌物種多樣性的研究上[53-54]，并發(fā)揮著越來越大的作用(表3)。

表2 AM真菌的檢測(cè)Table 2 AM fungi detection

表3 AM真菌群落多樣性Table 3 AM fungi community diversity

4 宿主植物養(yǎng)分吸收

多項(xiàng)研究表明，AM真菌與植物共生可以促進(jìn)宿主對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，改善宿主的營養(yǎng)狀況(表4)。例如AM真菌可以有效緩解植物根際的養(yǎng)分匱乏現(xiàn)象，促進(jìn)磷的吸收利用。研究發(fā)現(xiàn)，珠狀巨孢囊霉(G.margarita)與紫云英(A.sinicus)共生可以誘導(dǎo)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因如GigmPT、AsPT1和AsPT4的表達(dá)[57]。在AM共生體中，AM真菌可以依靠細(xì)胞膜上的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將土壤中的無機(jī)磷酸鹽(主要是H2PO4-形式的正磷酸鹽)轉(zhuǎn)運(yùn)到根外菌絲中，然后再借助AM特異性的植物磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將質(zhì)外體內(nèi)的游離態(tài)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到植物的皮層細(xì)胞，將其運(yùn)輸進(jìn)入寄主體內(nèi)[64]。更重要的是，AM真菌還可以從土壤中吸收多聚磷酸鹽，并通過多聚磷酸酶將其轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽，有利于植物吸收利用[65]。有研究者推測(cè)，AM共生體之所以可以特異性誘導(dǎo)植物磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，是因?yàn)锳M中可能存在著一種參與叢枝形成的細(xì)胞信號(hào)物質(zhì)可以激活此類基因的表達(dá)[66]。例如，Drissner等[67]發(fā)現(xiàn)，在AM共生體中存在一種名為溶血卵磷脂的物質(zhì)，它可以特異性誘導(dǎo)番茄中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)。番茄中的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因如LePT4、LePT5，這兩個(gè)基因在植物體與根內(nèi)球囊霉形成AM共生體后可以被特異性的激活表達(dá)[58]。水稻(Oryzasativa)接種蘇格蘭球囊霉(G.caledonium)、光壁無梗囊霉(A.laevis)、摩西球囊霉等AM真菌可以特異性誘導(dǎo)植物體內(nèi)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsPT11的表達(dá)[59]。珠狀巨孢囊霉可以誘導(dǎo)日本百脈根(Lotusjaponicus)中磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LjPT4特異性表達(dá)[60]。

土壤中鋅的缺乏會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量及品質(zhì)的降低，這已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在的問題。韓亞超等[61]選取ZIP家族Zn轉(zhuǎn)運(yùn)基因AsZIP2，利用RT-PCR與定量PCR方法檢測(cè)紫云英與珠狀巨孢囊霉共生時(shí)AsZIP2基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AM真菌的侵染強(qiáng)烈地抑制了AsZIP2的表達(dá)，而施加Zn會(huì)誘導(dǎo)AsZIP2的表達(dá)，這說明ZIP家族蛋白質(zhì)可以促進(jìn)植物對(duì)Zn的吸收，對(duì)緩解植物缺鋅起著關(guān)鍵作用。

AM真菌影響宿主植物養(yǎng)分吸收不全表現(xiàn)為正效應(yīng)，也有研究發(fā)現(xiàn)AM真菌會(huì)下調(diào)相關(guān)基因表達(dá)，抑制養(yǎng)分吸收。如摩西球囊霉與蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)共生可以提高C4固定路徑相關(guān)基因的表達(dá)，降低氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)[62]。段建鋒等[63]對(duì)小麥(T.aestivum)接種摩西球囊霉等AM真菌，發(fā)現(xiàn)下調(diào)了植物根內(nèi)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT、NAR和AMT的特異性表達(dá)。

5 宿主植物抗逆蛋白及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)

AM真菌可以通過調(diào)節(jié)脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)，抵御包括干旱、鹽堿、滲透壓等在內(nèi)的不利環(huán)境因素(表5)。例如HOG1基因，它是一個(gè)與抵御高滲透壓環(huán)境相關(guān)的基因，這已在多個(gè)物種中均有報(bào)道[76-77]。根內(nèi)球囊霉與蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)共生，鹽脅迫條件下，接菌植株中基因R.iHOG1的表達(dá)量較未接菌的對(duì)照植株提高了2倍，這說明根內(nèi)球囊霉促進(jìn)了基因R.iHOG1的表達(dá)，增強(qiáng)了寄主植物抵抗?jié)B透壓脅迫的能力[78]。

同樣，還有多項(xiàng)研究表明AM真菌可以影響糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的特異性表達(dá)。Balestrini等[68]發(fā)現(xiàn)，地表球囊霉(G.versiforme)可以誘導(dǎo)豌豆(Pisumsativum)中PsNlec1基因的特異性表達(dá)，這種基因可以編碼凝集素糖蛋白的合成。另有研究發(fā)現(xiàn)，根內(nèi)球囊霉可以特異性上調(diào)番茄體內(nèi)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因LeST3的表達(dá)，而近明球囊霉(G.claroideum)則下調(diào)此基因的表達(dá)。這兩種AM真菌均可以特異性誘導(dǎo)水稻中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsMST4和OsMST7的表達(dá)[63]。

另外，AM真菌還可以影響植物體其他多種基因的表達(dá)。根內(nèi)球囊霉與蒺藜苜蓿共生可以促進(jìn)Rho家族蛋白的表達(dá)，這類蛋白與共生關(guān)系的建立密切相關(guān)，如RiRho1蛋白可能與叢枝菌根真菌的萌發(fā)及定向生長有關(guān)，而RiCDC42蛋白則與附著胞形成及侵入栓的形成有關(guān)[69]。黃志等[70]發(fā)現(xiàn)，甜瓜(Cucumismelo)與摩西球囊霉共生可以誘導(dǎo)編碼P5CS的基因MeP5CS的表達(dá)。在對(duì)酸棗(Ziziphusjujuba)[71]和紫穗槐(Amorphafruticosa)[72]的研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌還可以誘導(dǎo)代謝相關(guān)蛋白、能量相關(guān)蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、蛋白合成相關(guān)蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、脅迫和防御相關(guān)蛋白等的差異性表達(dá)。

6 展望

分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物-微生物互作，對(duì)于AM真菌而言，有關(guān)AM共生體的研究已涉及較深層次的分子層面，且取得了較大進(jìn)展，為后續(xù)進(jìn)一步揭示AM真菌調(diào)控共生關(guān)系建立和維持的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)，但傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、生態(tài)學(xué)及生理生化等研究技術(shù)同樣重要，正是由于這些傳統(tǒng)的研究方法，促進(jìn)了人們對(duì)AM真菌的認(rèn)知，引發(fā)了國際上諸多學(xué)者對(duì)AM真菌研究的熱情，推動(dòng)了菌根學(xué)的形成。當(dāng)前，AM真菌的研究應(yīng)注重傳統(tǒng)方法與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，如在分類鑒定中，有效利用形態(tài)學(xué)、顯微技術(shù)、生物學(xué)、代謝學(xué)及現(xiàn)代分子生物技術(shù)，使得分類系統(tǒng)逐步完善，分類方法更加科學(xué)。在AM真菌功能多樣性和遺傳多樣性方面，亦應(yīng)加強(qiáng)生物學(xué)、生態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，從宏觀、微觀尺度解析AM真菌功能多樣性。在AM真菌資源利用方面，充分發(fā)揮我國生物多樣性高，AM真菌資源豐富的特點(diǎn)，通過高通量、轉(zhuǎn)錄組、宏基因組等分子生物技術(shù)、蛋白組學(xué)、顯微技術(shù)與生物學(xué)、生態(tài)學(xué)等傳統(tǒng)方法結(jié)合，充分發(fā)揮AM真菌在生態(tài)環(huán)境建設(shè)與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的作用，減少化肥農(nóng)藥施用，推進(jìn)綠色、可持續(xù)發(fā)展，實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略。