何青云，劉笑瑋，焦裕冰，俞芳菲，申莉莉，楊金廣，王鳳龍

（中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，山東青島266101）

0 引言

【研究意義】植物bZIP類轉錄因子參與植物的生長發(fā)育、激素信號、抗病性及抗逆性等多種生物過程[1]。bZIP基因的啟動子序列包含多種脅迫響應相關的順式作用元件，可與脅迫應答基因啟動子的順式作用元件結合，從而作出調節(jié)反應。通過突變和轉基因技術創(chuàng)造bZIP突變體，明確bZIP轉錄因子對植物抗病性的調控機理，有助于通過基因工程手段提高植物的抗病性?！厩叭搜芯窟M展】高溫、干旱、鹽害等逆境脅迫及細菌和病毒入侵均導致內(nèi)質網(wǎng)中未/錯折疊蛋白積累，產(chǎn)生內(nèi)質網(wǎng)應激（ER stress）。植物中已知3類ER應激感知因子：RNA剪切因子IRE1、膜相關的亮氨酸拉鏈bZIP轉錄因子和NAC轉錄因子。擬南芥在發(fā)生應激時，細胞首先啟動未折疊蛋白應答（unfolded protein response，UPR）。通過bZIP28途徑啟動UPR信號，上調分子伴侶（BiP、PDI、CAM）促進蛋白折疊；通過bZIP60途徑持續(xù)UPR，且bZIP60能通過調控NAC103放大UPR信號；通過IRE1依賴性降解（regulated IRE1α-dependent degradation，RIDD）途徑降解分泌蛋白的mRNA，控制蛋白合成[2-6]。不能正確折疊的蛋白進入內(nèi)質網(wǎng)相關降解（ER-associated degradation，ERAD）途徑被降解。目前，bZIP28是最清楚的非生物脅迫響應通路[7-10]，bZIP60在細菌、病毒侵染脅迫響應中發(fā)揮作用[11-13]。UPR是細胞檢測到內(nèi)質網(wǎng)中的未/錯誤折疊蛋白而作出的適應性反應。但持續(xù)過強的脅迫會引起細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），通過bZIP28/bZIP60調控NAC089通路，激活下游的PCD基因（NAC094、MC5、BAG6），主動殺死一些感染細胞而保護其他細胞[14-16]。PCD作為生物體的防御保護機制，其最終結果是細胞凋亡。顯然，寄主細胞的過早死亡不利于病毒復制和建立持續(xù)感染，因此病毒會利用寄主的UPR，抑制PCD，建立一種在存活細胞中復制病毒蛋白的平衡關系。如馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）侵染本氏煙（Nicotiana benthamiana）3 d，UPR基因（BiP、bZIP60和SKP1）轉錄水平提高3倍，過表達BiP能緩解內(nèi)質網(wǎng)應激相關的PCD癥狀[17]；水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）侵染本氏煙原生質體2 d，誘導BiP、bZIP60、PDI、CAM表達上調2.5—3.5倍[18]；大蒜X病毒（Garlic virus X，GarVX）侵染本氏煙3 d，誘導bZIP60和BiP表達上調9.5—10.6倍，且產(chǎn)生與UPR相關的PCD[19]；煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）侵染本氏煙2 d，內(nèi)質網(wǎng)應激相關的UPR基因BiP、PDI、CAM、bZIP28、bZIP60及PCD基因NAC089顯著上調[20-21]。上述研究顯示內(nèi)質網(wǎng)應激相關的UPR及其PCD是植物響應病毒侵染脅迫的信號。【本研究切入點】前期研究表明，轉錄因子 NbbZIP28其前體蛋白定位于內(nèi)質網(wǎng)膜，去跨膜域（transmembrane domain，TMD）及其后的C端序列的截短蛋白定位于細胞核。本氏煙接種TMV或CMV后2 d，NbbZIP28的轉錄水平顯著提高。NbbZIP28沉默導致UPR相關基因的表達顯著被抑制，病毒的積累量顯著提高[21]。顯示 NbbZIP28為病毒侵染脅迫下的內(nèi)質網(wǎng)應激因子，但病毒對NbbZIP28的誘導激活及其在病毒侵染中的調控作用仍需驗證。CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一種由RNA指導的Cas9核酸酶對靶基因進行編輯的技術，用這一系統(tǒng)來定點敲除植物的一些基因，便于研究這些基因的生物學功能[22]。【擬解決的關鍵問題】為驗證UPR因子 NbbZIP28對病毒侵染脅迫的響應機制，基于CRISPR/Cas9技術創(chuàng)建NbbZIP28基因敲除突變體，植株接種病毒后采用 qRT-PCR檢測病毒外殼蛋白（coat protein，CP）基因和寄主UPR基因的表達，用Western blot檢測融合蛋白 NbbZIP28-GFP的水解激活，揭示NbbZIP28通過上調UPR信號和提高寄主防衛(wèi)反應而抑制病毒侵染增殖的作用。

1 材料與方法

試驗于 2015—2017年在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所病毒實驗室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 供試毒株 CMV-IB株系、TMV-GFP侵染性克隆、NbbZIP28-GFP由筆者實驗室保存；pORE-Cas9質粒由西南大學夏慶友老師惠贈[23]；供試大腸桿菌DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；供試農(nóng)桿菌LBA4404購自北京博邁德生物技術有限公司；供試本氏煙在溫室育苗盆中播種，26℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)至4—5葉期備用。

1.1.2 試劑與引物 PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒和RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；In-Fusion PCR Cloning Kits、RNA反轉錄試劑盒和一步法熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA表達載體的構建及轉化農(nóng)桿菌[24]根據(jù)NbbZIP28基因序列（GenBank登錄號：KX457971）設計并合成一對sgRNA寡聚核苷酸單鏈DNA，序列如表1，于PCR儀上退火延伸成DNA雙鏈，反應體系：5×Annealing Buffer for DNA Oligos 10 μL，上下游引物各 10 μL，Nuclease-Free Water 20 μL。反應程序：95℃ 2 min，充分變性；然后每8 s下降0.1℃，降至 25℃；4℃保存。用BsaI酶切表達載體pORE-Cas9，酶切產(chǎn)物凝膠回收，獲得線性化表達載體。將退火的sgRNA經(jīng)T4連接酶連接入線性化表達載體[23]，反應體系：退火的雙鏈DNA 2 μL，酶切產(chǎn)物 5 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，Nuclease-Free Water 10 μL。連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞 DH5α，菌液涂板（卡那霉素抗性）培養(yǎng)過夜。挑取單克隆為模板，以載體上的引物JC-F和靶位點的下游引物bZIP28-R（序列見表1）進行菌落PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序驗證。序列正確的克隆，提取質粒并轉化農(nóng)桿菌LBA4404，篩選陽性菌。

1.2.2 遺傳轉化煙草及轉基因植株檢測 將測序正確的農(nóng)桿菌菌液擴繁，離心收集菌體，用MS0重懸菌體，加入終濃度為20 μmol·L-1的乙酰丁香酮（AS）。無菌條件下侵染本氏煙葉盤，將被侵染的葉盤置于含有NAA、6-BA和卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選陽性小芽，將其移栽到含50 mg·L-1Kan的培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。取葉片組織提取基因組 DNA，以引物mbZIP28-F/R（表1）擴增靶位點上下游共400 bp的片斷，將擴增片斷連接到pEASY-T1載體上，挑取單克隆測序并分析突變位點。T0代陽性植株經(jīng)套袋留種、檢測，收獲T3代。與野生型比較，記錄發(fā)芽率、生育期和植株生物學性狀。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

1.2.3 突變體對病毒侵染脅迫的敏感性及對 UPR信號的調控 4—5葉期突變體和野生型盆栽苗，分別于2片展開葉上浸潤或摩擦接種TMV-GFP。于紫外燈下觀察病毒的初侵染和系統(tǒng)擴展癥狀。摩擦接種CMV-IB后0 h（未接種）、12、24、48 h取接種葉（每株僅取同葉位一片，每時間點3—4次重復）提取RNA，反轉錄成cDNA，采用qRT-PCR檢測UPR基因BiP、PDI、CAM、NF-YC2的表達；5—7 d檢測接種葉中病毒CP的表達。以Actin為內(nèi)參，以各時間點上野生型中基因的Ct值為標準1，采用2-△△C計算突變體中基因的相對RQ值[20-21]。

1.2.4 序列比對分析NbbZIP28用在線搜索工具 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）在NbbZIP28啟動子區(qū)域尋找可能存在的順式作用調節(jié)元件[25-26]。根據(jù)擬南芥AtbZIP28序列中 bZIP和TMD結構域、S1P和S2P酶切位點，比對分析煙草NbbZIP28序列中的功能位點[8]。

圖1 NbbZIP28基因敲除突變體的創(chuàng)建Fig. 1 The construction of knockout mutant of NbbZIP28 by CRISPR/Cas9

1.2.5 病毒侵染對NbbZIP28水解激活的誘導 為明確病毒侵染對NbbZIP28水解激活的誘導，提前24 h摩擦接種TMV，提前48 h接種CMV，對照組接種無菌水，然后在接種葉上浸潤轉染NbbZIP28-GFP。48 h后提取轉染葉全蛋白進行Western blot檢測[20]。植物全蛋白提取采用 Solarbio試劑盒。保持上樣蛋白濃度一致，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜。取出PVDF膜封閉 1 h，一抗（Anti-GFP antibody-ChIP Grade ab290）按1∶2 000稀釋，4℃過夜孵育，二抗（Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) ab205718）按1∶5 000稀釋，室溫孵育1 h。用TBST緩沖液洗膜后置于化學發(fā)光成像分析儀中，滴入600 μL ECL發(fā)光液（SuperSignal West Pico Trial Kit），進行化學發(fā)光拍照。

2 結果

2.1 NbbZIP28基因敲除突變體的創(chuàng)建

表達載體pORE-Cas9經(jīng)BsaI酶切產(chǎn)生線性化表達載體后，與目的基因NbbZIP28的sgRNA片段連接，電泳檢測到450 bp的目的片段，顯示sgRNA表達載體構建成功（圖 1-A）。測序結果顯示插入目的片段中含有靶位點20 bp的核苷酸序列，表明sgRNA成功連接到pORE-Cas9/gRNA載體中（圖1-B）。采用農(nóng)桿菌介導的植物轉化技術，獲得了9株T0代陽性轉化苗。以陽性苗基因組 DNA為模板，用mbZIP28-F/R引物擴增含有NbbZIP28的靶位點片段，電泳結果顯示預期大小的400 bp片段，表明NbbZIP28敲除載體已成功轉入到煙草植株中（圖1-C）。測序顯示Cas9蛋白預期切割區(qū)域丟失10個堿基（圖1-D），導致翻譯錯誤、蛋白功能變化。

測序篩選至 T3代純合轉基因植株，命名為mNbbZIP28。采用無菌土播種培養(yǎng)至現(xiàn)蕾期，突變體與野生型種子的發(fā)芽率和植株表型無顯著差異。說明NbbZIP28突變未導致可見的植株生物學性狀變化，轉錄因子 NbbZIP28可能在植物的抗逆反應中發(fā)揮作用。

2.2 突變體mNbbZIP28對病毒侵染脅迫的敏感性

突變體mNbbZIP28與野生型（WT）植株浸潤接種TMV-GFP后4 d，紫外燈下統(tǒng)計顯示突變體植株的浸潤斑綠色熒光顯著明亮于野生型植株，第5—6天病毒擴展至上部葉片，擴展速度顯著快于野生型植株。摩擦接種TMV-GFP后4 d，突變體植株接種葉上的初侵染點顯著多于野生型植株；第5天病毒擴展至上部新葉，擴展速度顯著快于野生型植株；到第8天新葉上布滿病毒，差異逐漸縮?。▓D2）。

摩擦接種CMV后4—6 d，突變體mNbbZIP28植株接種葉和新葉上的花葉和卷曲癥狀較野生型植株明顯嚴重，第8天兩者的花葉癥狀均更加明顯，但隨后差異逐漸縮?。▓D3-A）。qRT-PCR檢測5—7 d接種葉中病毒含量，突變體中CMV的積累量顯著高于野生型（圖 3-B）。上述結果同之前沉默植株上的表現(xiàn)相同，即與野生型相比，沉默或敲除NbbZIP28后植株對病毒的敏感性上升，說明在病毒侵染早期，NbbZIP28有提高寄主基礎防衛(wèi)反應，抑制和延緩病毒侵染的作用。

圖2 突變體和野生型植株浸潤（A）或摩擦（B）接種TMV-GFP的癥狀Fig. 2 The symptom of TMV-GFP by infiltrate- (A) or rub-inoculation (B) on mNbbZIP28 and wild type

圖3 突變體和野生型植株接種CMV的癥狀（A）及接種葉中病毒RNA相對含量（B）Fig. 3 The symptom of inoculation CMV (A) and mRNA accumulation levels (B) in mNbbZIP28 or wild type

2.3 NbbZIP28對病毒誘導的UPR途徑的調控

野生型和突變體mNbbZIP28接種CMV后0 h（未接種）、12、24、48 h，以野生型為對照，采用qRT-PCR檢測突變體中UPR基因NF-YC2、BiP、CAM、PDI的表達。將mNbbZIP28植株各時間點基因的轉錄水平分別與野生型植株相應時間點做比較，結果顯示不接種病毒0 h時，相對于野生型中各基因的表達，突變體中NF-YC2、BiP、CAM、PDI的表達量分別為1.021、1.037、1.038、0.997，野生型和突變體中各UPR基因的表達量在不接種0 h時無顯著差異。接種后12 h，突變體中NbbZIP28的下游基因NF-YC2的表達量顯著低于野生型，說明NbbZIP28突變后抑制了下游NF-YC2的轉錄；此外，BiP、CAM、PDI的轉錄水平在12 h均被極顯著抑制，隨后24—48 h逐漸恢復，甚至顯著提高，PDI在48 h的表達極顯著提高（圖4）。

圖4 敲除NbZIP28對CMV引起的UPR相關基因表達的影響Fig. 4 Knock-out NbbZIP28 responses to the expression of UPR-related genes upon CMV infection stress

2.4 NbbZIP28的序列分析及病毒侵染誘導NbbZIP28水解

NbbZIP28啟動子序列經(jīng)分析，其中包含5個參與熱應激反應的順式作用元件（heat stress response element，HSE）、3個參與低溫反應的順式作用元件（low temperature response element，LTR）、1個參與防衛(wèi)和應激反應的順式作用元件（TC-rich repeats），見表 2。這些脅迫相關的順式作用元件可能調節(jié)bZIP28在脅迫條件下的表達。例如，NbbZIP28的啟動子中含有防衛(wèi)和應激反應的順式作用元件，因此病毒侵染誘導NbbZIP28上調表達，基因敲除突變體對病毒的敏感性上升。

NbbZIP28的結構分析顯示，朝向胞質的N端含bZIP結構域，朝向ER腔的C端含TMD結構域。存在S1P識別區(qū)（RRIL）、VASI序列和螺旋斷裂G殘基以及參與Sar1b綁定和Golgi移位的成對賴氨酸（圖5-A）。預示煙草NbbZIP28與AtbZIP28具有相同的水解激活和移位機制。

野生型本氏煙植株分別摩擦接種H2O 24 h、H2O 48 h、TMV 24 h、CMV 48 h，在接種葉上浸潤融合蛋白NbbZIP28-GFP（圖5-B）后48 h，Western blot檢測顯示融合蛋白 NbbZIP28-GFP的條帶大小約為115.61 kD。接種H2O、TMV或CMV后，一條約63.03 kD的條帶和一條約36.30 kD的條帶被誘導，其分子質量分別與S1P和S2P位點水解產(chǎn)生的條帶大小相對應。與H2O處理相比，TMV或CMV處理的條帶顯著清晰（圖5-C），表明相對于機械摩擦無菌水，TMV或CMV侵染顯著促進了NbbZIP28的水解激活。

表2 NbbZIP28啟動子區(qū)域參與應激反應的順式作用元件Table 2 Stress-related cis-acting regulatory elements identified in the promoter region of NbbZIP28

3 討論

NbbZIP28基因敲除突變體對病毒的敏感性與沉默植株的表現(xiàn)相同，即沉默或敲除NbbZIP28后，在早期病毒的積累量顯著高于野生型，后期無顯著差異。這顯示NbbZIP28為植物抵抗病毒侵染脅迫的早期防衛(wèi)信號，具有抑制和延緩病毒擴展的作用。那么內(nèi)質網(wǎng)應激因子NbbZIP28是如何負調控病毒侵染和增殖的？

首先，NbbZIP28為植物bZIP家族成員，其N末端有保守的bZIP結構域，也是DNA結合區(qū)，C末端的轉錄調控區(qū)保守性較低，含有跨膜域（TMD）和核定位（NLSs）；具有參與Sar1b綁定和Golgi移位的成對的賴氨酸，以及 S1P識別區(qū)（RRIL）。預測NbbZIP28具有與AtbZIP28相同的激活轉移機制，即應激時前體蛋白脫離內(nèi)質網(wǎng)膜轉移至 Golgi，經(jīng) S1P和S2P蛋白酶裂解，產(chǎn)生活性形式進入細胞核發(fā)揮作用。前期研究表明NbbZIP28-GFP定位在內(nèi)質網(wǎng)上，去掉跨膜區(qū)及其后C端序列的NbbZIP28ΔC-GFP定位在細胞核內(nèi)[21]。這一結果在本文的研究中進一步得到證實，即TMV或CMV侵染，誘導全長的NbbZIP28-GFP在S1P和S2P蛋白酶位點發(fā)生裂解，產(chǎn)生約63.03和36.30 kD的兩條帶。但尚未證實NbbZIP28轉移至Golgi的過程，通過順面高爾基體小泡Marker（ERD2-

GFP）及反面高爾基體 Marker（ST-GFP）與 RFPNbbZIP28蛋白的共定位可以驗證。

圖5 NbbZIP28的結構及Western blot檢測病毒侵染激活NbbZIP28-GFPFig. 5 Map of NbbZIP28 and Western blot analysis of the processing of NbbZIP28-GFP by virus infection

其次，病毒侵染后檢測UPR基因的表達，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體中 UPR基因（BiP、PDI、CAM、NF-YC2）的表達在侵染前期 12 h顯著被抑制。BiP、PDI、CAM的表達在24—48 h逐漸恢復甚至提高。這與之前沉默植株上的表現(xiàn)一致，即病毒侵染前期 12 h，NbbZIP28沉默或敲除導致 UPR基因的表達顯著被抑制，顯示NbbZIP28是UPR途徑的正調控因子；但BiP、CAM、PDI的這種轉錄抑制在后期逐漸恢復，甚至提高，暗示還有其他的UPR途徑補充NbbZIP28的作用，NbbZIP28不是唯一的UPR調控因子。這一結果與擬南芥中衣霉素誘導BiP在2—4 h上調表達、在bZIP28突變體中先被抑制后逐漸恢復的趨勢[27]相一致。這一現(xiàn)象說明基因的功能可能為：病毒侵染復制產(chǎn)生的大量病毒蛋白導致內(nèi)質網(wǎng)應激，寄主細胞首先啟動UPR防衛(wèi)反應，上調伴侶蛋白的表達，抑制病毒蛋白的復制。但NbbZIP28并非寄主的抗病毒基因，不能持續(xù)抑制病毒的復制和轉運。相反，病毒會利用寄主的UPR，最終建立一種在存活細胞中復制病毒蛋白的平衡關系。顯然，病毒在特定宿主內(nèi)調節(jié)和利用UPR的能力強烈影響其致病力，闡釋這一機制是控制病毒侵染與致病的關鍵。

此外，研究表明bZIP家族轉錄因子與植物的抗病和逆境脅迫應答密切相關。目前，信號轉導通路研究較清楚的是擬南芥，AtbZIP17響應高鹽脅迫，能提高植物的耐鹽性[27]；AtbZIP60響應內(nèi)質網(wǎng)應激誘導劑衣霉素或二硫蘇糖醇及高溫脅迫[4]；AtbZIP28除被內(nèi)質網(wǎng)應激誘導劑誘導外，還在 42℃高溫脅迫響應和激素信號轉導中起調控作用[27]。作物中的研究則集中于抗病和抗逆[28]，例如，煙草NtbZIP60是精胺信號的重要原件，抑制野火病菌侵染[11]；水稻OsbZIP23能提高幼苗的耐鹽性和抗旱性[29]；玉米ZmbZIP72能提高作物對鹽害的耐受能力；ZmbZIP28能響應圓斑病菌脅迫并提高作物抗性[10]。谷子在干旱或鹽害脅迫時，有近 1/2或 1/3的 bZIP基因的表達量發(fā)生顯著變化，其中鹽脅迫誘導SibZIP28下調表達[30]。NbbZIP28啟動子序列包括熱應激響應元件（HSE）、低溫響應元件（LTR）、防御和應激響應元件（TC-rich repeats）；且NbbZIP28基因沉默或敲除引起了對病毒敏感性的上升，普通煙中也存在同源基因NtbZIP28，因此后期可以做過表達分析，即完整驗證基因的功能，也有望利用植物bZIP轉錄因子提高寄主基礎抗病性。

4 結論

通過 CRISPR/Cas9技術和煙草遺傳轉染獲得NbbZIP28敲除突變體。正常生長條件下，突變體與野生型無顯著差異，但對TMV或CMV侵染脅迫的敏感性上升，病毒誘導的UPR基因表達被抑制。TMV或CMV侵染誘導NbbZIP28-GFP在S1P和S2P蛋白酶位點發(fā)生裂解。內(nèi)質網(wǎng)應激因子 NbbZIP28在病毒侵染早期能激活UPR信號以提高寄主防衛(wèi)反應，從而延緩病毒的侵染和增殖。