金澄艷，呂曉陽，高雯，王悅，陳煒昊，盛水興，陳玲，林杰，孫偉

（1揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州225009；2蘇州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇蘇州215200；3丹陽市皇塘鎮(zhèn)動物防疫站，江蘇丹陽213027）

0 引言

【研究意義】湖羊是中國獨有的白色羔皮羊品種，也是世界著名的多胎綿羊品種。其羔皮呈水波狀花紋，色澤潔白、毛質(zhì)柔軟、撲而不散，在國內(nèi)外裘皮市場享有盛譽。毛囊作為皮膚的衍生物，調(diào)節(jié)湖羊毛發(fā)的生長，可分為生長有髓毛的初級毛囊和生長無髓毛的次級毛囊。毛囊的發(fā)育及其再生由多種信號傳導(dǎo)途徑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和表觀遺傳調(diào)節(jié)因子控制[1-3]。miRNA是參與轉(zhuǎn)錄后表達水平調(diào)節(jié)的重要因子，是表型調(diào)控的重要潛在位點。目前對 miRNA的功能已有一定的了解，但其在毛囊發(fā)育中的作用機制還不完全清楚。研究與毛囊生長發(fā)育相關(guān)的候選 miRNA可進一步了解湖羊毛囊的生長發(fā)育，從分子遺傳規(guī)律上揭示湖羊羔皮形成不同花紋的分子機理及其調(diào)控機制，從而制定提高湖羊羔皮質(zhì)量的育種方案?！厩叭搜芯窟M展】目前，在綿羊、山羊和鴨等動物上，已有使用皮膚和毛發(fā)或毛囊中的 miRNA表達譜來鑒定與毛囊發(fā)育和生長相關(guān)的miRNA[4-8]。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA能夠影響皮膚毛囊細(xì)胞的增殖分化及毛色[9]，其相關(guān)靶基因在調(diào)控毛囊周期性生長的過程中充當(dāng)重要的角色[10-12]。目前，miRNA-143已被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，在這些惡性腫瘤細(xì)胞中高表達miR-143，細(xì)胞生長會受到限制，這也就提示miR-143參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡及新陳代謝過程[13-20]。let-7c和let-7i都屬于極為重要的抑癌 miRNA的let-7家族，在多種惡性腫瘤中低表達，其可以調(diào)控部分與細(xì)胞周期相關(guān)的基因，參與細(xì)胞凋亡過程[21-23]。miR-199a-3p參與細(xì)胞的增殖、發(fā)育等生物學(xué)過程，miR-199a-3p可以抑制癌細(xì)胞的生長，減少腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵染[24-28]。此外，miR-199a-3p還參與C2C12成肌細(xì)胞的細(xì)胞分化[29]。miRNA-10a也參與細(xì)胞的增殖、遷移等過程，但與miR-199a-3p抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵染相反，miRNA-10a能夠促進腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[30-31]?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期利用安捷倫基因芯片技術(shù)及GO功能分析，篩得初生湖羊大花和小花皮膚組織差異表達基因，如 BMP7、MMP2、SNAI1、SFXN1、CDKNIC、MT3、POU1F1等對湖羊大花、小花性狀形成可能具有重要影響的候選基因[32]?；谇捌诶酶咄繙y序技術(shù)及生物信息學(xué)分析篩選湖羊大花、中花、小花羔皮毛囊差異表達miRNA，結(jié)果表明miRNA-143、miRNA-10a、let-7c、miRNA-199a-3p、let-7i 、NW_004080189.1_7961、NW_004080184.1_6535、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080166.1_9139、NW_004080181.1_3961、NW_004080174.1_726、NW_004080166.1_10417、NW_004080190.1_13733等候選miRNA可能參與湖羊不同花紋的形成，但尚無這些差異表達 miRNA在湖羊羔皮毛囊中表達值與毛囊發(fā)育之間的詳細(xì)資料。目前關(guān)于綿羊毛囊的研究主要集中于生長周期的研究[2]，關(guān)于miRNA表達與毛囊發(fā)育的研究在湖羊這一優(yōu)質(zhì)羔皮用羊品種上尚屬空白。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過分析剛出生湖羊大花、中花、小花毛囊發(fā)育狀況和miRNA-143、miRNA-10a、let-7c、miRNA-199a-3p、let-7i、W_004080189.1_7961、NW_004080184.1_6535等14個候選miRNA表達變化及兩者相關(guān)性，揭示這14個miRNA在毛囊發(fā)育中的作用，篩選候選miRNA，為湖羊優(yōu)質(zhì)羔皮的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

研究于2014年8—12月在揚州大學(xué)動物遺傳育種與分子設(shè)計實驗室完成。

1.1 試驗群體

選取6組出生2d內(nèi)的湖羊全同胞個體（由蘇州市種羊場提供），每組全同胞個體分別包含大、中、小花各一只。在湖羊羔羊活體狀態(tài)下，從其背側(cè)部成股拔取羊毛，在距離羊毛根部毛囊泡1cm處用剪刀將羊毛剪斷，放入裝有Trizol的1.5mL離心管中。一般情況下，每個1.5mL離心管中加入1mL Trizol，毛囊收集至Trizol體積的1/3，并用小型塑料研磨杵在離心管內(nèi)迅速研磨，一般研磨時間為 1min左右，完成后蓋好，用封口膜封好離心管。輕甩離心管使毛囊完全浸入到Trizol液體中，在避光條件下，24h內(nèi)將裝有樣品的離心管放入-20℃凍存?zhèn)溆?。將羔羊另一?cè)背側(cè)部剪毛，剪取約1.5 cm2的皮膚組織，并將其展平貼于硬紙板上，連同硬紙板一起放入裝有 4%甲醛溶液的離心管中固定備用。

1.2 主要試劑及儀器

miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒、ABI 7500熒光定量PCR儀、石蠟切片機、甲醛、蘇木素、伊紅、中性樹脂等。

1.3 石蠟切片的制作

將羔皮皮膚組織按常規(guī)石蠟切片制片流程，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、H.E染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察毛囊結(jié)構(gòu)，并利用顯微成像系統(tǒng)拍照，每張切片選擇3個不同視野，統(tǒng)計初級毛囊數(shù)、次級毛囊數(shù)、初級毛囊直徑、次級毛囊直徑，并用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），統(tǒng)計分析毛囊各指標(biāo)在大、中和小花之間的差異顯著性。

1.4 Real-time PCR

采用Trizol 法提取樣品RNA。利用天根miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒生成miRNA對應(yīng)的cDNA。引物由上海生工合成，引物信息見表1。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量，反應(yīng)體系參考天根miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（天根，目錄號：FP401）說明書。

表1 熒光定量引物序列Table 1 Relevant information of genes and primers sequence for RT-PCR

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt方法計算相對表達量，其中 ΔCt＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt＝ΔCt（大花組、中花組）－ΔCt（小花組），利用 SPSS17.0 計算重復(fù)樣品間的 Ct均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用單因素方差分析（ANOVA）進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 湖羊大、中、小花不同花紋羔皮毛囊的組織學(xué)觀察

湖羊大花、中花和小花羔皮皮膚組織切片顯微照片如圖1所示，毛囊各指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果如表2。

從圖1湖羊大、中和小花毛囊切片照片中可以看出，在大花、中花和小花羔皮毛囊中，直徑較大的為初級毛囊，直徑相對較小的為次級毛囊，毛囊分布以毛囊群形式為主，即以初級毛囊為中心，次級毛囊圍繞在初級毛囊的一側(cè)。

表2毛囊各指標(biāo)數(shù)據(jù)顯示，在顯微鏡相同視野中，湖羊大花、中花、小花3種不同類型花紋羔皮的初級毛囊數(shù)差異不顯著（P＞0.05）；小花組的次級毛囊數(shù)多于大花組和中花組的次級毛囊數(shù)且差異極顯著（P＜0.01），中花組與小花組二者次級毛囊數(shù)相仿，差異不顯著（P＞0.05）。因此，在相同的單位面積中，小花的毛囊總數(shù)要高于大花組和中花組。大花組的初級毛囊直徑比中花組和小花組的初級毛囊直徑要大的多，與中花組和小花組的初級毛囊直徑均差異極顯著（P＜0.01），大花組的次級毛囊直徑也比中花組和小花組的次級毛囊直徑大，同時二者差異極顯著（P＜0.01），中花組和小花組二者的初級毛囊直徑以及次級毛囊直徑均差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 湖羊大花、中花、小花毛囊橫切圖Fig. 1 Transverse section images of large, medium and small waves（100×）

表2 湖羊大、中、小花毛囊各指標(biāo)測定Table 2 Determination indexes of large, medium and small waves

2.2 實時熒光定量PCR結(jié)果

為驗證測序數(shù)據(jù)的可靠性，本研究從測序篩選出的顯著差異miRNA中隨機選取了5個，利用與測序送樣相同的樣品進行了熒光定量 PCR驗證。測序結(jié)果與差異表達的miRNA的RT-PCR基本相同（表3）。

2.3 14個差異miRNA在大花、中花和小花羔皮毛囊中的表達

由表4可知，在已知的miRNA中，miRNA-143在大花組中的表達量與小花組差異極顯著（P＜0.01），miRNA-10a在小花組的表達量與大花和中花組相比差異顯著（P＜0.05），let-7i在大花組的表達量與中花組差異顯著（P＜0.05）；在測序新預(yù)測的差異miRNA中， NW_004080184.1_6326在中花組的表達量與大花組差異顯著（P＜0.05），與小花組差異極顯著（P＜0.01），NW_004080165.1_8572在中花組的表達量與大花組和小花組差異極顯著（P＜0.01），NW_004080181.1_3961在中花組的表達量與小花組差異極顯著（P＜0.01），NW_004080190.1_13733在中花組的表達量與大花組差異極顯著（P＜0.01）。其余miRNA在大、中和小花中的表達差異不顯著。

2.4 14個差異miRNA熒光定量表達值與毛囊各指標(biāo)的相關(guān)分析

根據(jù)6組湖羊（大花組、中花組和小花組）背側(cè)部皮膚組織切片各指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果及14個miRNA在3組花型中的表達情況，利用SPSS17.0軟件進行相關(guān)性分析，分別計算14個miRNA與3組不同花紋毛囊指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)，分析14個miRNA表達情況與毛囊各指標(biāo)的相關(guān)性。分析結(jié)果如表5所示：14個 miRNA的相對表達量均與毛囊部分指標(biāo)存在相關(guān)性，表明14個miRNA均有可能參與毛囊的生長發(fā)育。通過使用SPSS 17.0分析了14種miRNA的表達與毛囊各組織學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，表明它們參與毛囊的生長和發(fā)育。

表3 差異miRNA的測序與熒光定量Table 3 The companions on the results of sequencing and RT PCR for differentially expressed miRNA

表4 大花、中花、小花毛囊14個miRNA相對表達量Table 4 Relative expression quantities of 14 miRNAs in large, medium and small waves hair follicle

表5 14個miRNA相對表達量與毛囊組織學(xué)特性關(guān)聯(lián)分析Table 5 Correlation between the expressed miRNA and the indicators follicles

續(xù)表5 Continued table 5

3 討論

3.1 14個miRNA在湖羊大、中和小不同花紋個體間的表達

在這些miRNA中，miRNA-143作為測序所篩得的湖羊毛囊組織表達豐度較高的 miRNA之一，在本研究的結(jié)果中顯示，miRNA-143同一時期在小花中的表達量遠(yuǎn)高于大花和中花，且在大花和小花羔皮毛囊中的表達量差異極顯著。由此可推測，miRNA-143很可能參與毛囊細(xì)胞的發(fā)育過程，參與被毛生長的調(diào)控。但是，關(guān)于miRNA-143在動物毛囊領(lǐng)域的研究尚未有相關(guān)報道，以前的研究表明，miRNA-143在各種惡性腫瘤中起重要作用[33-34]。據(jù)報道，miRNA-143在膀胱癌[16]、前列腺癌[18]、乳腺癌[19]和胃癌[20]中表達下調(diào)，在這些惡性腫瘤中，miR-143的表達上調(diào)抑制了細(xì)胞的生長。

miRNA-10a以及l(fā)et-7i兩個miRNA的研究目前也主要集中于腫瘤方面，在動物毛囊領(lǐng)域也尚無報道。miRNA-10a在腫瘤中的作用主要體現(xiàn)在它能促進腫瘤細(xì)胞的增殖和分化過程[30-31]，這一點與let-7i正好相反，let-7i作為重要的抑癌miRNA家族let7家族的一員，它在腫瘤細(xì)胞中低表達，參與細(xì)胞凋亡過程[22-23]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-10a和let-7i分別在湖羊中花與小花、大花與中花中的表達量差異顯著，由此推測，miRNA-10a和let-7i在不同花紋羔皮毛囊中的差異表達可能會對湖羊毛囊的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

在新miRNA中，NW_004080184.1_6326在小花與大花中的表達量高于中花，且小花組的表達量與中花組差異極顯著，NW_004080165.1_8572在大花與小花中的表達量高于中花組且均與中花組差異極顯著，NW_004080181.1_3961和NW_004080190.1_13733分別在中花和小花組、大花和中花組差異極顯著。這些通過測序得到的新的 miRNA在湖羊不同花紋羔皮毛囊中的差異表達，也很可能在羔皮花紋的形成過程中發(fā)揮重要作用，這也需要后續(xù)實驗的進一步驗證。此外，其余的7個miRNA在大、中、小花3組的表達差異均不顯著，暫時不列入候選miRNA的選擇范圍。因此，可初步推測miRNA-143、miRNA-10a、let-7i、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961、NW_004080190.1_13733 等7個 miRNA可以作為參與湖羊毛囊發(fā)育調(diào)控的候選miRNA。

3.2 14個miRNA在湖羊不同花紋羔皮毛囊中的表達與毛囊各指標(biāo)之間的相關(guān)分析

目前，通過對人類以及模式動物如小鼠等miRNA的研究已證實，miRNA在腦、心臟、肝臟、皮膚等各種組織及器官的發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[35-39]，而且 miRNA的表達還呈現(xiàn)出不同發(fā)育階段特異性表達和組織特異性表達的特點。當(dāng)前對于皮膚及毛囊的研究表明，miRNA參與多種動物表皮的發(fā)生及毛囊的生長發(fā)育過程。ANDL等進一步研究表明，miRNA在毛囊周期性生長的不同時期的表達存在差異性，miRNA是調(diào)控皮膚和毛囊生長發(fā)育過程的重要因子[40]。關(guān)于 miRNA-143在動物毛囊領(lǐng)域的研究目前還尚未有相關(guān)報道，miRNA-143主要在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程的調(diào)控。本研究結(jié)果表明，在miRNA-143表達量相同的情況下，小花次級毛囊數(shù)大于大花次級毛囊數(shù)，這與切片結(jié)果相符，結(jié)合miRNA-143在大花、中花和小花間表達差異研究初步推測，miRNA-143可能對湖羊毛囊發(fā)育起調(diào)控作用。

目前關(guān)于miRNA-10a和let-7i也尚無毛囊生長發(fā)育方面的研究，本研究結(jié)果顯示，在miRNA-10a表達量相同的情況下，大花初級毛囊直徑大于小花次級毛囊直徑，大花次級毛囊數(shù)小于中花和小花的次級毛囊數(shù)，這些結(jié)果與切片數(shù)據(jù)相吻合。此外，在let-7i表達量相同的情況下，結(jié)果顯示大花次級毛囊數(shù)小于中花次級毛囊數(shù)，而在切片結(jié)果中，大花的次級毛囊數(shù)和中花的次級毛囊數(shù)接近，差異并不顯著，因此在這一點與切片數(shù)據(jù)稍有出入；出現(xiàn)此情況可能是由于樣本量不足導(dǎo)致的，因為本試驗的研究對象為湖羊大、中和小花不同花紋的全同胞個體，此類全同胞個體較為稀少。但在let-7i表達量相同的情況下，大花初級毛囊直徑大于中花初級毛囊直徑，這一結(jié)果還是符合切片結(jié)果的。因此，這些相關(guān)性分析結(jié)果與相應(yīng)的切片數(shù)據(jù)基本吻合。此外，在所篩得的新miRNA中，NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961以及 NW_004080190.1_13733等在大、中和小花組的表達量也分別與大花次級毛囊直徑、小花次級毛囊數(shù)和中花次級毛囊直徑等指標(biāo)存在相關(guān)性，且分析結(jié)果也與切片數(shù)據(jù)相符合。其余的miRNA雖然與毛囊的相關(guān)指標(biāo)也存在關(guān)聯(lián)性，但鑒于其在大、中和小花組的表達差異不顯著，可將其排除在候選miRNA的選擇范圍之外。

4 結(jié)論

綜合14個miRNA在大花、中花和小花毛囊中的表達情況以及表達值與毛囊各指標(biāo)的相關(guān)性分析，miRNA-143、miRNA-10a、let-7i、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961和NW_004080190.1_13733可以作為湖羊羔皮毛囊發(fā)育的重要候選miRNA，在后續(xù)試驗中將進行更深入的研究。