朱珊珊 王蘊龍 龐傳超

白介素-22(Interleukin，IL-22)是最近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種CD4+Th細(xì)胞因子，由Th17和Th22為主的免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生，主要生物學(xué)功能為微生物防御、保護和修復(fù)組織損傷及急性期反應(yīng)，IL-22雖由這些細(xì)胞產(chǎn)生，卻不作用于它們，在皮膚主要特征性的作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，其獨特的免疫介導(dǎo)形式使其在很多炎癥性、自身免疫性、腫瘤性皮膚病中發(fā)揮重要作用。扁平苔蘚是一種臨床上比較常見的累及皮膚黏膜的瘙癢性慢性炎癥性疾病，病因尚未完全明確，可能是由遺傳、感染、藥物、自身免疫、慢性病灶、精神神經(jīng)、內(nèi)分泌與代謝障礙等相互作用導(dǎo)致的[1]，多數(shù)支持多因素影響的T細(xì)胞介導(dǎo)的針對基底細(xì)胞的免疫反應(yīng)。目前關(guān)于IL-22在扁平苔蘚中的作用研究較少，本文研究IL-22在扁平苔蘚皮損中的表達(dá)，并以正常皮膚作為對照，以探討其在疾病中的可能意義，為扁平苔蘚的診斷和治療開辟新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 實驗組30例：為2016年1～11月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科經(jīng)臨床和病理檢查確診為扁平苔蘚患者的病變皮膚，其中男18例，女12例，年齡為19～63歲，平均年齡(42.3±8.4)歲。所有實驗組病變的特點是具有相似程度的炎癥反應(yīng)，且無本病以外的糖尿病、高血壓、感染性和過敏性疾病或其他自身免疫性疾病，如銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等，且近3個月未系統(tǒng)或局部應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、抗生素等藥物。對照組10例為2016年1～11月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚外科手術(shù)切除的正常皮膚，其中男5例，女5例，年齡為22～66歲，平均年齡(45.6±7.3)歲。所有對照組均無免疫系統(tǒng)疾病，無皮膚感染，兩組對象年齡、性別相匹配。

1.2 主要試劑 兔抗人IL-22多克隆抗體、兔抗體免疫組化試劑盒、DAB顯色液均來自北京欣博盛生物科技有限公司。檸檬酸鈉抗原修復(fù)液來自碧云天生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測 將切除的組織標(biāo)本放入4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋備用，將包埋的組織切片4 μM厚度，用于HE和免疫組化染色觀察。免疫組化染色(SABC法)按照欣博盛提供的兔抗體免疫組化試劑盒的說明進(jìn)行，遵循每批染色以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 結(jié)果判定 以細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒狀染色為陽性標(biāo)準(zhǔn)，由2位具有獨立判斷能力的醫(yī)師采用雙盲法對實驗結(jié)果進(jìn)行判定。在光鏡下計數(shù)，40×10倍視野下，于每個組織片內(nèi)隨機選取5個視野，用5 mm×5 mm網(wǎng)格目鏡微尺分別計算陽性細(xì)胞數(shù)及觀察的細(xì)胞總數(shù)，取其平均值，計算陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率，根據(jù)染色強度以及著色范圍進(jìn)行半定量評分，結(jié)果分析方法根據(jù)Shimizu[2]法改良而成。染色強度用0～3級評分:0分為無染色，1分為輕度染色，2分為中度染色，3分為強染色；著色范圍采用陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率計分，用0～3級評分：<20%為0分，20%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。以上兩項相加為著色程度積分，表示IL-22在皮損中的表達(dá)強弱，結(jié)果:0、1分為陰性(-)；2分為弱陽性(+)；3～4分為陽性(++)；5～6分為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用兩等級資料比較的Mann-Whitney U秩和檢驗進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01為有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 見圖1。

2.2 免疫組化染色結(jié)果 見圖2、3，表1。在30例實驗組中，IL-22主要表達(dá)于扁平苔蘚表皮全層的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮淺層浸潤的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。其中16例為強陽性，8例為陽性，4例為弱陽性，2例為陰性。在10例對照組中，IL-22也表達(dá)于正常皮膚組織，主要定位于基底層附近的角質(zhì)形成細(xì)胞中，呈淡黃色顆粒。其中1例為強陽性，2例為陽性，4例為弱陽性，3例為陰性。由表1可看出，IL-22在扁平苔蘚皮損中的表達(dá)水平明顯高于在正常皮膚組織中的表達(dá)水平，二者差異經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 a:表皮角化過度，顆粒層楔形增厚，棘層不規(guī)則增厚;b:基底細(xì)胞液化變性，真皮淺層致密淋巴細(xì)胞帶狀浸潤(a HE，×100；b HE，×200)

圖2 IL-22在扁平苔蘚中的表達(dá)(2a,2c SABC，×100；2b,2d SABC，×400)

圖3 IL-22在正常皮膚中的表達(dá)(3a SABC×100；3b SABC×400)

表1 IL-22在扁平苔蘚和正常皮膚組織中的表達(dá)

注：采用Mann-Whitney U test，P<0.01為有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異

3 討論

扁平苔蘚是一種臨床上比較常見的特發(fā)性炎癥性疾病，占皮膚科所有就診患者的0.5%以上[3]，皮損部位不一，可同時或先后累及一個或多個區(qū)域，皮膚和口腔黏膜是最常受累的部位。目前認(rèn)為免疫機制和角質(zhì)形成細(xì)胞障礙活化介導(dǎo)了扁平苔蘚的發(fā)生，但確切的發(fā)病機制尚不清楚，IL-22是一種新型細(xì)胞因子，它在外周組織損傷期間介導(dǎo)著免疫細(xì)胞向上皮細(xì)胞間信號的傳遞，引起上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗菌蛋白和炎癥介質(zhì)。IL-22具有兩種結(jié)合受體--膜性受體(IL-22R)和可溶性受體(IL-22RA2)，膜性受體是由IL-22R1與IL-10R2構(gòu)成的異源二聚體受體復(fù)合物，因細(xì)胞因子對IL-22R1具有很高的親和力，該受體的表達(dá)也決定了組織細(xì)胞對IL-22的反應(yīng)性。IL-22R1的分布具有一定的組織特異性，主要表達(dá)于皮膚、腎臟、胰腺、肺臟等的實質(zhì)細(xì)胞，特別是在角質(zhì)形成細(xì)胞和胰腺，而在NK和單核等免疫細(xì)胞中不表達(dá)[4]。IL-22RA2是一種天然的蛋白性抑制劑，能競爭性結(jié)合IL-22并阻斷其生物學(xué)活性[5]，進(jìn)而干預(yù)細(xì)胞因子下游的信號傳導(dǎo)。IL-22作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗炎因子或保護蛋白，如IL-11、卵泡抑素、β-防御素、鈣結(jié)合蛋白A7、A8、A9等，重塑傷口愈合，發(fā)揮固有防御機制，防止皮膚感染。另外，IL-22可以下調(diào)終末期角質(zhì)形成細(xì)胞分化基因，抑制其分化產(chǎn)物的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞向遠(yuǎn)處遷移的能力[6]。除此之外，IL-22還能誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，即IL-6和趨化因子(CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6和CXCL8)[7]，誘導(dǎo)皮膚顯著增生和炎癥反應(yīng)。目前人類中IL-22主要由活化的Th22、Th1、Th17細(xì)胞產(chǎn)生[8]，這些細(xì)胞已被證實在感染性、免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著廣泛的生物活性，提示IL-22升高存在于T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病如銀屑病、扁平苔蘚中。本文試驗發(fā)現(xiàn)在扁平苔蘚皮損部位，IL-22表達(dá)水平較正常人皮膚明顯增高(P<0.01)，提示IL-22參與了扁平苔蘚皮損的形成。

既往的研究表明，扁平苔蘚的特征在于針對上皮細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，引起表皮細(xì)胞損傷和真皮淺層T淋巴細(xì)胞浸潤，產(chǎn)生其特征性的的病理改變和臨床表現(xiàn)。與扁平苔蘚發(fā)病機制相關(guān)的細(xì)胞主要有CD4+T、CD8+T、樹突狀細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞，其中效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞即輔助性T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與了扁平苔蘚發(fā)病的各個方面。IL-22在扁平苔蘚皮損中表達(dá)明顯增多，同樣提示Th17、Th22細(xì)胞免疫參與其致病過程，這與以往的報道一致。當(dāng)皮膚收到各種因素刺激時，CD4+T細(xì)胞激活，CD8+T細(xì)胞活化，將被處理過的內(nèi)源性或外源性抗原信息呈遞給T細(xì)胞，釋放TNF-α、IL-22等因子。我們大膽的猜測，IL-22與受體結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號激活，進(jìn)一步活化下游信號傳導(dǎo)通路，包括JAK/STAT通路(Jak1、Tyk2、STAT3)和MAPK通路(p38MAPK、JNK、EPKl/2)，啟動下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、抑制其凋亡和分化，誘導(dǎo)其產(chǎn)生調(diào)節(jié)防御機制的細(xì)胞因子、抗微生物肽，加強皮膚防御功能。過度表達(dá)的IL-22可能需要達(dá)到一個閾值才能引起炎癥反應(yīng)，使激活的STAT3持續(xù)磷酸化，表達(dá)一系列基因產(chǎn)物，如Caspases、bcl-2、生存素、p53、p63，分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等，Caspases、bcl-2、p53均為細(xì)胞凋亡標(biāo)志物，激活后引起細(xì)胞凋亡，即出現(xiàn)凋亡小體，導(dǎo)致同時基底細(xì)胞液化變性，淋巴細(xì)胞凋亡缺失或減弱，可能也是炎癥細(xì)胞持續(xù)浸潤的一個原因[9]。除此之外，通過MAPK途徑激活的p38參與激活促炎分子、趨化因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等表達(dá)，亦可與TNF-α協(xié)同作用促進(jìn)CSF、IL-8的釋放，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞向炎癥部位游走，放大炎癥效應(yīng)，形成真皮淺層T細(xì)胞帶狀浸潤，促進(jìn)細(xì)胞凋亡與基底細(xì)胞液化變性。浸潤細(xì)胞繼續(xù)分泌TNF-α、IL-TIF等細(xì)胞因子，致使病情反復(fù)，病程延長。那么當(dāng)IL-22在皮損區(qū)異常表達(dá)時也就可能造成扁平苔蘚特征性皮損和病理改變。本研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)正常表皮中也有IL-22的表達(dá)，且多位于表皮基底層，考慮可能與IL-22的正向作用相關(guān)，適量表達(dá)的IL-22可以下調(diào)終末期角質(zhì)形成細(xì)胞分化基因，促進(jìn)正常表皮中細(xì)胞增殖、分化，而當(dāng)其過量表達(dá)時則造成皮膚顯著增生和炎癥反應(yīng)等現(xiàn)象。IL-22在不同疾病、不同組織中扮演雙刃劍的角色，考慮可能與該細(xì)胞因子的數(shù)量、持續(xù)時間、所處環(huán)境及浸潤的炎性細(xì)胞種類等因素有關(guān)。

近年來，越來越多的學(xué)者開始研究IL-22在扁平苔蘚發(fā)病機制中的作用，但目前這些研究還不成熟，僅是初步的。Domingues等[10]對外周血單核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測時發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞通過激活TLR7/8或SEB引起IL-22+T細(xì)胞(TC22、Th22細(xì)胞)數(shù)量頻繁增加，并能在LP患者中檢測到，這些增加可能導(dǎo)致IL-22分泌T細(xì)胞向皮膚或黏膜炎癥部位遷移。本次研究主要選取的對象是皮膚型扁平苔蘚皮損，目前國內(nèi)外學(xué)者對白介素在扁平苔蘚中的研究多集中于口腔型，Shen等[11]通過RT-qPCR和Western blot分析檢測IL-22和靶向微小RNA的表達(dá)時進(jìn)一步證實IL-22在口腔扁平苔蘚中高表達(dá)。而Chen等[12]、Weber等[13]研究時發(fā)現(xiàn)IL-22在口腔扁平苔蘚的表達(dá)高于皮膚型，有明顯的特異性。

扁平苔蘚皮損中T細(xì)胞的異?；罨捌渌a(chǎn)生的多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)引發(fā)了疾病的發(fā)生，但機體通過釋放更多的因子來調(diào)節(jié)自身的免疫平衡。在本研究中，我們探討了IL-22在扁平苔蘚中的表達(dá)情況，結(jié)果提示IL-22在疾病發(fā)病中可能具有一定作用。本研究并未證實IL-22的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度是否呈相關(guān)性，需要血清學(xué)檢查及跟蹤患者預(yù)后等進(jìn)一步觀察研究。此外，扁平苔蘚的發(fā)病過程受多因素影響，我們的實驗在取材和研究方法等諸多方面存在一定局限性，希望經(jīng)過我們的研究為深入揭示扁平苔蘚發(fā)病機制提供理論依據(jù)，為疾病的治療及預(yù)后提供新的靶點。