李 敏 ，黃 磊 ，王新杰 ，陳玉玲 ，盛 翔 ，李亞男 ，包 云 ，姜 磊 ，朱如心 ，徐倩南 ，張家碩 ，李成濤 ，邊英男

（1.溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，浙江 溫州 325235；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063；3.山東省公安廳，山東 濟南 250001；4.濰坊市公安局，山東 濰坊 261061；5.華東理工大學生物工程學院 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；6.蘇州大學醫(yī)學部法醫(yī)學系，江蘇 蘇州 215123；7.內蒙古醫(yī)科大學法醫(yī)學教研室，內蒙古 呼和浩特 010030）

Y-STR具有重要的法醫(yī)學應用價值，被廣泛用于男性家系排查和性犯罪男女混合成分檢驗等公安實戰(zhàn)和父系血緣關系評價當中[1-5]。Y-STR在取得可喜成績的同時也遇到了一些問題，由于Y-STR在不同種族中的遺傳異質性和目前廣泛使用的商品化試劑盒多以國外人群為主體參考樣本而開發(fā)，開發(fā)過程中雖經(jīng)過一定量中國人群驗證，但是其中一些基因座在大規(guī)模應用中已經(jīng)表現(xiàn)出了適應性不佳等問題[6-8]。部分試劑盒為提高單倍型識別能力特地加入了快速突變位點[9]，然而這又給家系排查帶來了困擾。因此，本課題組在前期工作的基礎上[10]，以山東人群為參考樣本，甄選并建立了由24個Y-STR基因座（DYS426、DYS434、DYS531、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、DYS391、DYS570、DYS635、DYS448、DYS593、DYS645、DYS393、DYS389 Ⅰ 、DYS390、DYS389 Ⅱ 、DYS596、DYS576、DYS458、DYS481、DYS385a/b、DYS443）構成的單倍型識別力較強、突變率適中、兼容性較好的YSTR復合擴增系統(tǒng)。本研究通過山東濟南漢族男性無關個體樣本對此擴增系統(tǒng)進行法醫(yī)學應用評估，以期為探索適合我國人群的Y-STR標記系統(tǒng)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究共收集并檢驗了139對父子的血痕樣本，所有志愿者均來自山東濟南漢族人群。樣本采集均遵循知情同意原則。

1.2 試劑與儀器

DNA標準品9948及9947A（美國Promega公司）和Hi-DiTM甲酰胺（美國AB公司）。9700型PCR儀（美國AB公司）和3130xl型基因分析儀（美國AB公司）。

1.3 位點說明

本研究評估的24個Y-STR基因座為DYS426、DYS434、DYS531、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、DYS391、DYS570、DYS635、DYS448、DYS593、DYS645、DYS393、DYS389Ⅰ、DYS390、DYS389Ⅱ、DYS596、DYS576、DYS458、DYS481、DYS385a/b 和 DYS443。其中，DYS19、DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS439、DYS448、DYS458、DYS635共14個基因座源自于歐洲YHRD（http://www.yhrd.org）推薦的 17 個基因座（除 DYS437、DYS438、DYS456、Y-GATA-H4 外）。根據(jù)本課題組前期研究[6]和文獻[7]報道，此14個基因座在山東人群中多態(tài)性良好、突變率適中，并且對單倍型識別能力貢獻較大，因此予以保留在系統(tǒng)。此外，考慮到本系統(tǒng)與其他商品化試劑盒的兼容性，我們保留了最小單體型（minimal haplotype，MHT）全部 9 個核心基因座（DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392和DYS393）。在此基礎上，根據(jù)我國山東人群[10-11]特點，按照突變率盡可能低和單倍型區(qū)分能力盡可能強的原則，篩選并添加了DYS443等11個基因座組成了24個Y-STR的復合擴增體系。其中，DYS426、DYS643、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596和DYS645均為前期研究[7]中突變率較低的位點，以便于利用Y-STR進行家系排查。

1.4 PCR擴增和分型

本研究采用課題組自行構建的五色熒光檢測體系對24個Y-STR基因座進行復合擴增。擴增采用10μL 體系，其中包括 6.0μL 去離子水、2.0μL 5×PCR反應預混液Ⅳ、2.0 μL 5×24Y引物混合物和直徑1.2mm的血痕樣本（FTA卡）。擴增條件：95℃ 2min；94℃ 5 s，60℃ 1 min，（30±1）個循環(huán)；60 ℃ 10 min；15℃低溫保存。擴增反應同時設置陽性和陰性對照分別為DNA標準品9948和9947A。擴增反應于9700型PCR儀在MAX模式下完成后，立即對擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳檢測，具體過程：取1μL擴增產(chǎn)物加于9μL上樣液（Hi-DiTM甲酰胺與內標ORG-500的17∶1混合液）中，經(jīng)95℃ 3min后冰浴3min，短暫離心后在3130xl型基因分析儀上進行毛細管電泳檢測，進樣時間為5s，電壓為3kV。電泳結果通過GeneMapper?ID v3.2.1軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行STR基因座分型，并根據(jù)國際法醫(yī)遺傳協(xié)會（the International Society for Forensic Genetics，ISFG） 最新推薦標準[12]進行各Y-STR等位基因的命名。

為了保證試劑盒的分型效果和準確性，選取9948、007、2800M標準品和從139對父子對中隨機抽取的3例樣本與AmpF?STRTMYfilerTM直擴試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行平行檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理

單倍型和等位基因頻率由直接計數(shù)法分析獲得，并計算每個基因座的突變率及其95%置信區(qū)間（http://statpages.org/confint.html）[13]。 基因多樣性（gene diversity，GD）和單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）根據(jù)Nei的公式[14]計算獲得，即

式中，Pi為第i個等位基因（或單倍型）的頻率，n為檢測樣本總量。單倍型識別率（discriminative capacity，DC）的計算公式為

式中，Ndiff為單倍型種類數(shù)目，N為樣本總量。

2 結 果

2.1 分型結果

實驗結果顯示，各樣本在24個Y-STR基因座均得到有效擴增，各個基因座擴增產(chǎn)物峰高均衡性較好。使用AmpF?STRTMYfilerTM直擴試劑盒平行驗證的結果顯示，標準品及隨機抽取的3例樣本在共有基因座的分型結果均完全一致，其中標準品9948的分型結果如圖1所示。

圖1 標準品9948分型結果

2.2 等位基因頻率和基因多樣性

24個Y-STR基因座在139名標記為“父”的山東濟南漢族無關男性個體中的等位基因頻率如表1所示。24個Y-STR基因座在139名山東濟南漢族無關男性個體中共觀察到176個等位基因。單拷貝STR基因座的等位基因頻率范圍為0.007 2～0.956 8，多拷貝STR基因座DYS385a/b的基因型頻率范圍為0.0072～0.1007。

24個Y-STR基因座的GD值見表2。24個Y-STR基因座的GD值為0.0837～0.9669，其中21個基因座的GD值均大于0.5，比例高達87.5%，在山東漢族人群中展現(xiàn)出較高多態(tài)性。多拷貝基因座DYS385a/b擁有最高的GD值（0.9669），緊隨其后的是基因座DYS570（0.8247）。 基因座 DYS645的 GD 值最低（0.0837）。

表1 山東濟南地區(qū)漢族無關個體24個Y-STR基因座的等位基因分布頻率 （n=139）

表1（續(xù)）

表2 山東濟南地區(qū)漢族無關個體24個Y-STR基因座GD值、標準品DNA 9948分型、等位基因范圍（n=139）

2.3 單倍型多樣性

研究結果顯示，24個Y-STR檢查系統(tǒng)在139名山東漢族男性無關個體中共檢測出139種單倍型，無共享單倍型現(xiàn)象出現(xiàn)。系統(tǒng)的HD、DC值均為1。

2.4 突變率評估

如表3所示，24個Y-STR基因座在139對父子間的3336次減數(shù)分裂中共觀察到5次一步突變，分別為 DYS390基因座 1次、DYS458基因座 1次、DYS385a/b基因座2次和DYS443基因座1次。24個Y-STR基因座的平均突變率為0.001 5，95%置信區(qū)間為（0.0005，0.0035）。本研究在YHRD推薦基因座以外新增的 11 個基因座中（DYS426、DYS481、DYS570、DYS576、DYS643、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596和DYS645）的平均突變率為0.000 7，95%置信區(qū)間為（0.000 0，0.003 6），其中在現(xiàn)有商品化試劑盒中鮮有出現(xiàn)的 DYS426、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596和DYS645的平均突變率為0.0010，95%置信區(qū)間為（0.0000，0.0057）。

表3 山東濟南地區(qū)漢族139個父子對在24個Y-STR基因座的突變情況

3 討 論

本研究的24個Y-STR基因座中有21個基因座的GD值均大于0.5，比例高達87.5%。根據(jù)文獻[15-16]報道，以目前廣泛使用的AmpF?STRTMYfilerTMPCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）為例，其GD值均大于0.5的基因座比例在82.4%～88.2%，因此本研究的24個Y-STR基因座具有較高的多態(tài)性。本研究在YHRD推薦基因座以外新增的11個基因座中有9個GD值大于0.5，其中 DYS434、DYS443、DYS531、DYS593和DYS596在現(xiàn)有商品化試劑盒中鮮有出現(xiàn)。因此，本研究的24個Y-STR系統(tǒng)不但可以獨立應用，而且可以為商品化試劑盒提供補充。

由于Y-STR的連鎖遺傳，雖然考察各基因座GD值對于基因座的篩選具有一定意義，但簡單將GD值最高的基因座組合得到的位點系統(tǒng)并不必然具有最高的HD和DC，即未必有最好的個體識別能力。因此，評估Y-STR系統(tǒng)法醫(yī)學應用前景的決定性指標是HD和DC。本研究的24個Y-STR檢查系統(tǒng)，在139名山東漢族男性無關個體中未觀察到共享單倍型現(xiàn)象，其HD值和DC值均為1。目前廣泛使用的AmpF?STRTMYfilerTMPCR擴增試劑盒 HD值和DC值分別在 99.97%[17]～99.99%[18]和 76.14%[17]～98.66%[18]，表明該系統(tǒng)具有較高的單倍型識別能力和良好的法醫(yī)學應用前景。

本研究的24個Y-STR基因座在139對父子間的3 336次減數(shù)分裂中共觀察到5次突變，平均突變率為 0.0015，95%置信區(qū)間為（0.0005，0.0035）。 其中在24個基因座中YHRD推薦基因座以外新增的11個基 因 座 （DYS426、DYS481、DYS570、DYS576、DYS643、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596 和DYS645）的平均突變率為0.000 7，95%置信區(qū)間為（0.0000，0.0036），而在現(xiàn)有商品化試劑盒中鮮有出現(xiàn)的 DYS426、DYS434、DYS443、DYS531、DYS593、DYS596和DYS645基因座的平均突變率為0.0010，95%置信區(qū)間為（0.0000，0.0057）。 目前廣泛使用的 AmpF?STRTMYfilerTMPCR 擴增試劑盒、AmpF?STRTMYfilerTMPlus PCR擴增試劑盒和PowerPlex?Y23 System試劑盒（美國 Promega 公司）突變率分別為 0.21%[19]～0.27%[20]、0.44[21]～0.46%[22]和 0.37%[23]～0.38%[24]。因此，本研究評價的系統(tǒng)可以在一定程度上降低因突變帶來的困擾，特別是在作為其他試劑盒補充使用時，可以提供相當數(shù)量的低突變位點。

本研究在YHRD推薦基因座以外新增的DYS426和DYS645多態(tài)性較低，考慮到其突變率較低的特點，將其保留在本系統(tǒng)中，我們將在以后更大樣本的研究中對其進行考察。Y-STR系統(tǒng)的應用效果會受到被檢人群的影響。因此，本研究針對我國人群，以山東男性人群為參考樣本，對前期甄選的24個Y-STR基因座進行了法醫(yī)學評價，結果顯示，該系統(tǒng)不但具有較強的單倍型識別力而且突變率適中，并且在與其他試劑盒具有一定兼容性的同時還可以作為目前廣泛使用的商品化試劑盒的補充。結合王新杰等[4]的研究，本研究評價的系統(tǒng)在其他漢族人群中具有良好應用前景的可能性較高，但是最終效果仍須通過實際樣本驗證評估。希望通過對該系統(tǒng)的法醫(yī)學評價，為探索適合本地區(qū)和我國人群的Y-STR標記系統(tǒng)提供參考數(shù)據(jù)。