高洋　朱雯雨　穆祥

摘要：為比較黃連、白頭翁、秦皮、黃柏和馬齒莧對脂多糖（LPS）刺激大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RIMVECs）后中性粒細(xì)胞（PMNs）釋放殺菌酶及內(nèi)源性抗菌肽（rCRAMP）表達(dá)的影響。建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系，試驗分為LPS對照組、LPS+黃連組、LPS+黃柏組、LPS+白頭翁組、LPS+秦皮組和LPS+馬齒莧組，運用ELISA和Western Blotting（WB）較全面系統(tǒng)地研究了以上5種中藥對LPS刺激RIMVECs后PMNs殺菌酶釋放及rCRAMP表達(dá)的變化。當(dāng)LPS刺激RIMVECs后，與LPS對照組相比，LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs彈性蛋白酶（NE）分泌量顯著增加；LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs組織蛋白酶（CG）分泌量明顯增加，LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs溶菌酶（LYS）分泌量極顯著增加，LPS+黃連組rCRAMP相對表達(dá)量顯著升高。結(jié)果表明，黃連和白頭翁明顯促進LPS刺激RIMVECs后PMNs釋放殺菌酶和表達(dá)rCRAMP，對機體起保護作用。

關(guān)鍵詞：中藥；脂多糖（LPS）；殺菌酶；內(nèi)源性抗菌肽（rCRAMP）

中圖分類號：S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2018）05-0005-03

近年來，隨著中藥國際化進程的加快，中藥對于某些疾病良好的治療效果得到國際上廣泛認(rèn)可，并且在歐美國家出現(xiàn)“中藥熱”現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，龍芩草因含黃芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸等對H1N1流感病毒有一定的抵抗作用[1]；黃連、黃柏、白頭翁、秦皮及馬齒莧等中藥可提高機體細(xì)胞免疫功能并能促進多種細(xì)胞因子的分泌[2-6]，常用于治療或輔助治療感冒等疾病。中性粒細(xì)胞可分泌彈性蛋白酶（NE）和組織蛋白酶（CG）調(diào)控機體炎癥反應(yīng)[7，8]，溶菌酶（LYS）和內(nèi)源性抗菌肽（rCRAMP）是天然的具有抗菌活性的蛋白質(zhì)，中性粒細(xì)胞（PMNs）分泌LYS和rCRAMP是其能夠殺滅細(xì)菌的原因之一[9，10]。由于黃連、黃柏、白頭翁、秦皮及馬齒莧5味中藥對PMNs作用的影響未見詳細(xì)報道，故為探究以上5味中藥對脂多糖（LPS）刺激RIMVECs后PMNs釋放殺菌酶和表達(dá)rCRAMP的影響，本研究以RIMVECs和PMNs為研究對象，在成功建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系基礎(chǔ)上，運用ELISA和Western Blotting（WB）試驗方法，較系統(tǒng)地闡述以上5味中藥對PMNs在炎癥反應(yīng)中的影響，為黃連、白頭翁、秦皮等中藥在獸醫(yī)臨床中應(yīng)用以及作為飼料添加劑等提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。rCRAMP抗體，OmnimAbs公司；NE、CG和LYS檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；白頭翁、黃連、黃柏、秦皮和馬齒莧，北京同仁堂藥店。

1.2 儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱，SANYO公司；電泳儀，BIO-RAD公司等。

1.3 方法

1.3.1 黃連、白頭翁、黃柏、秦皮和馬齒莧的煎制處理 取以上5種中藥各50 g，分別放入藥罐中，加10倍體積去離子水浸泡30 min?？旎鸢舅帲序v后，調(diào)慢火維持沸騰30 min，收集藥液，使用200目篩趁熱過濾。加入8倍體積去離子水煎煮1 h，收集藥液，趁熱過濾。加入4倍體積去離子水煮1 h，收集藥液，趁熱過濾。將3次收集的藥液合并過濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，將5種中藥水煎液的濃度濃縮至1 g/mL，于80 ℃真空干燥箱中干燥處理，冷卻后密封，于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 分組及處理 參考本實驗室已建立的鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系[4]，利用Transwell通透性支持物進行試驗。當(dāng)體系中RIMVECs匯合至80%～90%時，用D-hanks清洗2次，將細(xì)胞分為6組，即LPS對照組（LPS+DMEM）、LPS+黃連組（LPS+HL）、LPS+黃柏組（LPS+HB）、LPS+白頭翁組（LPS+BTW）、LPS+秦皮組（LPS+QP）、LPS+馬齒莧組（LPS+MCX）。分別加入1.5 mL 10 μg/mL的LPS預(yù)處理4 h，藥物組分別加入1.5 mL上述中藥（200 μg/mL黃連、200 μg/mL黃柏、100 μg/mL白頭翁、500 μg/mL秦皮和1 mg/mL馬齒莧，通過預(yù)試驗獲得藥物安全濃度），LPS對照組加無血清的DMEM培養(yǎng)液，藥物組分別加入2.6 mL DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃的5%CO2中培養(yǎng)24 h。各組中加入提取好的PMNs（5×106個/mL），同時加入2.6 mL 2%1640培養(yǎng)基，孵育3 h后收集樣品并標(biāo)記。

1.3.3 對PMNs遷移RIMVECs后釋放NE、CG和LYS的檢測 將細(xì)胞上清液以3 000 r/m離心10 min去除顆粒物，依據(jù)試劑盒說明書操作步驟進行NE、CG和LYS檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算NE、CG和LYS分泌量。

1.3.4 對PMNs遷移RIMVECs后rCRAMP的表達(dá) 提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，依據(jù)WB步驟檢測rCRAMP表達(dá)量，以目的蛋白質(zhì)與actin的灰度比值表示目的蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析 本試驗數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism5進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義；P>0.05表示差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中藥對跨內(nèi)皮細(xì)胞PMNs分泌NE、CG的影響

當(dāng)LPS刺激RIMVECs后，依據(jù)不同中藥對RIMVECs遷移PMNs及正常未跨越RIMVECs的PMNs的NE和CG的分泌量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1、圖2），R2均大于0.95，根據(jù)試劑盒使用要求，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線均可用。與LPS+DMEM組相比，LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的NE分泌量顯著增加（P<0.05）；與LPS+DMEM組相比，LPS+HL組PMNs的CG分泌量極顯著增加（P<0.01），LPS+BTW組CG釋放量顯著增高（P<0.05），其余中藥組沒有顯著變化（圖3、圖4）。

2.2 不同中藥對跨內(nèi)皮細(xì)胞PMNs分泌溶菌酶的影響

當(dāng)LPS刺激RIMVECs后，測定不同中藥對RIMVECs遷移PMNs及正常未跨越RIMVECs的LYS分泌量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），依據(jù)試劑盒使用要求R2大于0.95，即繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。與LPS+DMEM組相比，LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的LYS分泌量極顯著增加（P<0.01）；LPS+HB和LPS+QP組PMNs的LYS分泌量增加，但差異不顯著（P>0.05）（圖6）。

2.3 不同中藥對PMNs跨內(nèi)皮后rCRAMP表達(dá)的影響

當(dāng)LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，LPS+HL組rCRAMP的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05），LPS+BTW和LPS+QP組rCRAMP的相對表達(dá)量也增加，但差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果顯示在rCRAMP表達(dá)上，中藥黃連的保護作用更明顯（圖7、圖8）。

3 討論

NE是由PMNs分泌的炎癥介質(zhì)，正常劑量NE可緩解感染對機體的損傷，但高劑量NE可降解膠原蛋白、層黏連蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)，并通過EGFR、p38MAPK、ERK等信號通路調(diào)節(jié)黏液蛋白的分泌[7]。CG是由PMNs和單核細(xì)胞分泌產(chǎn)生的絲氨酸亞型組織蛋白酶，其通過水解活化細(xì)胞因子調(diào)控炎癥。當(dāng)LPS刺激RIMVECs后，與LPS+DMEM組相比，LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的NE分泌量顯著增加（P<0.05）；與LPS+DMEM相比，LPS+HL和，LPS+BTW組PMNs的CG分泌量極顯著或顯著增加（P<0.01，P<0.05），以上結(jié)果揭示黃連和白頭翁通過修復(fù)RIMVECs后，使得PMNs被激活釋放NE和CG，其作用機制可能為：黃連和黃柏含有豐富的黃連素、多糖等物質(zhì)，而白頭翁含白頭翁素等有效成分，當(dāng)LPS+黃連或白頭翁等作用細(xì)胞后，黃連素和白頭翁素可能與RIMVECs表面的受體相互作用進而激活胞內(nèi)相關(guān)信號通路，被激活后的RIMVECs釋放大量趨化因子，如IL-18、IL-1和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，這些物質(zhì)會刺激并激活PMNs，激活后的PMNs將胞內(nèi)顆粒釋放到胞外，后者含大量NE和CG，能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7]。

LYS是一種天然抗菌蛋白，由PMNs等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生。主要針對革蘭氏陽性菌有殺滅或抑制作用。rCRAMP是哺乳動物體內(nèi)具有抗菌作用的小分子多肽類物質(zhì)，不同物種間內(nèi)源性抗菌肽具有功能上的高度保守，具有抑制細(xì)菌、真菌、病毒等作用，又能促進趨化因子釋放，還可中和LPS并減輕內(nèi)毒素性休克。rCRAMP是大鼠中惟一的內(nèi)源性抗菌肽[9]，通過檢測LYS分泌量和rCRAMP表達(dá)量可更好的評判PMNs跨內(nèi)皮細(xì)胞后的抑菌或殺菌功能。當(dāng)LPS刺激RIMVECs后，與LPS對照組相比，LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的LYS分泌量極顯著增加（P<0.01），LPS+HL組rCRAMP的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05），結(jié)果顯示，在rCRAMP表達(dá)水平上，黃連的抑菌殺菌作用最明顯。PMNs膜表面的整合素蛋白與RIMVECs膜表面的ICAM受體蛋白結(jié)合后，PMNs形態(tài)發(fā)生變化而穿過RIMVECs，PMNs吞噬LPS而被激活，釋放出LYS和rCRAMP，而黃連和白頭翁等中藥的有效成分進一步促進PMNs釋放出LYS和rCRAMP，所以表現(xiàn)出LPS+HL或BTW組PMNs釋放LYS和表達(dá)rCRAMP顯著增加。

黃連、白頭翁、黃柏、秦皮和馬齒莧對LPS刺激RIMVECs后PMNs的NE、CG、LYS和rCRAMP表達(dá)均有不同程度的影響，其中黃連和白頭翁的促進表達(dá)作用效果顯著，說明以上兩種中藥可通過顯著增加PMNs的溶菌酶釋放和抗菌肽表達(dá)來提升保護效果，本研究為以上5種中藥在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用和作為飼料添加劑提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉曉艷.復(fù)方龍芩草微乳液抗H1N1流感病毒的作用、物質(zhì)基礎(chǔ)及機制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[2] 崔 巖，侯鳳琴，祝國強，等.黃連解毒湯對雛雞免疫功能及免疫器官的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，71（5）：135-137.

[3] 張 婕，張宏偉，王秋紅.鹽炙前后黃柏多糖基本含量測定及對免疫功能的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2017，44（6）：1263-1267.

[4] 劉曉曄，張 濤，董 虹，等.白頭翁湯對大鼠跨內(nèi)皮遷移的中性粒細(xì)胞溶菌酶的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2014，45（1）：142-146.

[5] 趙婧暉，謝鯤鵬，隋佳琪，等.秦皮素通過抑制EGFR及其下游AKT信號通路抑制MCF-7細(xì)胞增殖及遷移[J].中國生物化學(xué)及分子生物學(xué)報，2016，32（1）：56-63.

[6] 鄭麗明，毆江勇，黃秀云.馬齒莧治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的療效及其對血清中IL-8、TNF-α的影響[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2017，7（8）：25-27.

[7] 易 陽，周國平，鐘聞燕，等.中性粒細(xì)胞、白介素-8和彈性蛋白酶在急性毛細(xì)支氣管炎發(fā)病中的作用[J].臨床兒科雜志，2009，27（2）：148-151.

[8] 陳 駒，彭禮飛.組織蛋白酶G在炎癥疾病發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展[J].山東醫(yī)藥，2017，57（21）：98-100.

[9] 孫叢叢.內(nèi)源性抗菌肽Cathelicidins在慢性阻塞性肺疾病病理改變中作用的研究[D].濟南：山東大學(xué)，2014.

[10] BOBBY J，HOLLY P，CHARLES C.Mechanisms underlying mouse TNF-α stimulated neutrophil derived microparticle generation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，437：591-596.