喻麗珍，年四輝，李麗華，王 涵

肝癌（HCC）是全球常見的惡性腫瘤之一，近年來其死亡率居及轉移率居高不下，尤其是在發(fā)展中國家，其中50%以上發(fā)生在中國［1］.目前，外科手術治療仍然是肝癌治療最有效的方法，但術后腫瘤的轉移與復發(fā)是縮短患者生存期的主要原因，因此尋求有效的抑制肝癌轉移的藥物具有重要的臨床意義.

芒果苷（mangiferin）又稱知母寧、芒果素，芒果苷是一類從百合科植物知母、漆樹科植物芒果等中分離得到的一種多酚羥基二苯并吡喃酮類化合物.近年來國內外對芒果苷的藥理學研究主要包括抗腫瘤、抗氧化、調節(jié)脂代謝異常、抗糖尿病及其并發(fā)癥、心血管保護以及抗高尿酸血癥等［2］，其抗腫瘤作用日益受到關注.本研究以肝癌HepG2細胞為研究對象，通過觀察芒果苷對肝癌HepG2細胞遷移侵襲能力、細胞周期和細胞骨架等的影響，探討芒果苷抗肝癌細胞侵襲轉移的作用及可能機制，為其抗腫瘤的藥物研究提供實驗實驗依據.

1 材料

1.1 細胞系及細胞培養(yǎng)

人肝臟腫瘤細胞株（HepG2），購于ATCC.HepG2細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁，傳代周期為2～3d，取對數生長期細胞進行實驗.

1.2 藥物與試劑

芒果苷（成都曼思特生物科技有限公司，批號 must11110201）；胎牛血清（GIBCO，批號：1619679）；DMEM 培 養(yǎng) 基（GIBCO，批 號 ：C11995500BT）；胰酶（GIBCO，批號：1737903）；青霉素-鏈霉素（GIBCO，批號：1558746）；噻唑藍（SIGMA，批號：M5655）；二甲基亞砜（DMSO，Sin?opharm ChemicalReagentCo.Ltd，批 號 ：T20070917）；Actin-Tracker Green（碧云天生物技術公司，批號：C1003）；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：C1052）；CyclinD1 Antibody（恩晶生物技術有限公司，批號：E1A0931-2）；MMP2（Proteintech Group Inc，貨號：10373-2-AP）；山羊抗兔IgG二抗（MRbiotech，批號：115751）.

1.3 儀器

電子天平：DENVER，型號：SI-403；電子顯微鏡：optical instrument factory in Chongqin，型號XSZ-D2；CO2培養(yǎng)箱：Shanghai bright Medical In?strument Co.Ltd，型號YCP-200；恒溫水浴箱：CRYSTAL，型號SY-1210；高速冷凍離心機：美國科俊儀器公司；SH03014；Western電泳儀：美國Bio-Rad；曝光機：BIO-RAD，型號：Universal HoodⅡ；酶標儀：BioTek，型號：Synergy2；BD FACSCalibur流式細胞儀（BD，America）；熒光倒置顯微鏡：ZEISS顯微鏡.

2 實驗方法

2.1 分組及藥物處理

待細胞長滿時，棄上清液，PBS洗兩次，加入DMEM培養(yǎng)基.將細胞分為6組：①對照組；②芒果苷25μmol/L組；③芒果苷50μmol/L組；④芒果苷100μmol/L組；⑤芒果苷150μmol/L組；⑥芒果苷200μmol/L組.①組加DMEM，②～⑥組加入相應濃度的芒果苷，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.

2.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37%、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長貼壁達到亞融合狀態(tài)時，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞備用.

2.3 MTT法檢測HepG2的增殖活力

細胞經不同條件加藥處理24h后，96孔板每孔加20μL MTT（5mg/ml），37℃孵育4h，去上清，每孔加150μL DMSO溶解結晶物，搖床搖15min，于490nm下測吸光度（OD）值.芒果苷對HepG2增殖的抑制率（%）=（空白組OD490-給藥組OD490）/空白組 OD490*100%.

2.4 細胞劃痕實驗

取HepG2細胞經胰酶消化以2×104個細胞/孔接種于六孔板中，靜置培養(yǎng)24h.細胞生長至70%左右更換用無FBS的DMEM饑餓12h，進行同步后處理使大部分細胞處于G0/G1期，使用10μL無菌槍頭靠著直尺在單層細胞上劃直線，PBS漂洗去除細胞，然后分組加藥繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌三遍后于倒置顯微鏡下觀察細胞遷移到無細胞區(qū)域情況，拍照記錄，每皿任取三張，每組六張片進行觀察.

2.5 Transwell侵襲實驗

采用Transwell小室法檢測細胞的縱向遷移，將HepG2細胞用胰酶消化以1×105個細胞/孔接種于六孔板中，靜置培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)基，用無血清的培養(yǎng)基饑餓細胞12h，使細胞處于同步化.消化收集細胞并進行計數，用不含FBS的DMEML將細胞稀釋為密度1×105的懸液，待用.取已滅菌24孔培養(yǎng)板和底部帶有8μm濾膜的細胞小皿，培養(yǎng)板孔內加含有10%FBS的培養(yǎng)基800μL；用緩沖液濕潤小皿后放入培養(yǎng)板中使每個小室被培養(yǎng)液浸沒，每個細胞小室內（上室）加入分組加藥處理過的細胞懸液200μL，每小室內約含2×104個細胞，每組重復一個小室，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取出24孔培養(yǎng)板，用鑷子將小室取出，PBS漂洗小室，在小室翻轉后的底部滴加4%多聚甲醛，固定60min，PBS洗3次，風干后在固定面滴加DAPI染核，浸沒10min，PBS洗3次，將小室槽內細胞用棉簽抹干凈.將小室放于200倍鏡下觀察，并對遷移的藍色細胞進行拍照，每組拍六張觀察遷移狀況.

2.6 細胞骨架染色觀察

將HepG2細胞以胰酶消化接種于事先植入無菌蓋玻片的24孔板中，經不同條件處理后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每次5min，每孔加200μL預冷的4%多聚甲醛固定半小時，PBS洗3遍后每孔加含0.1%TritonX-100的PBS 200μL通透30min，PBS沖洗3次，每次5min.去除PBS后，避光滴加微絲綠色熒光探針染料，每片200μL，室溫下避光孵育60min后，PBS洗滌3次，每次5min.將蓋玻片勾出后倒扣于潔凈載玻片，有細胞的一面朝下，熒光顯微鏡下拍攝，每組拍3張片.

2.7 細胞周期檢測

細胞經不同條件處理后消化細胞和收集細胞懸液，1000 Rpm離心5min棄掉培養(yǎng)液，用預冷PBS洗滌細胞2次，離心去除PBS，加入預冷的75%的乙醇固定，4℃過夜.將乙醇固定的細胞懸液以1000 Rpm離心5min，去上清，PBS洗滌細胞，再離心，去除上清液，留下細胞沉淀，用PI染液按每個樣（染色緩沖液0.5mL+20x碘化丙啶25μL+50xRNase A10μL）配制，加入細胞沉淀中，37℃孵育30min，在激發(fā)波長488nm處，用儀器測紅色熒光，并檢測光散射，采集10000個細胞數據，數據用FlowJo軟件處理，分析不同周期細胞數量.

2.8 Westen blot檢測CyclinD1和MMP9蛋白表達

細胞經不同條件培養(yǎng)后用預冷的PBS洗滌3次，裂解后的細胞離心（12000 Rpm，15min，4℃）后取上清液測定其蛋白濃度，與上樣緩沖液混合于99℃下煮沸5min形成穩(wěn)定的蛋白樣品.取樣20μg，SDS-聚丙烯酰胺恒壓100V電泳分離蛋白，隨后將凝膠上蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2h，一抗4℃孵育過夜.TBST洗滌3次后加入二抗（山羊抗兔，1：10000稀釋）室溫孵育90min，TBST洗滌3次后，加入ECL發(fā)光液曝光.利用凝膠自動分析成像軟件Chemimage5500，以β-actin為內參進行分析.

3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行相關數據分析，采用t檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

4 實驗結果

4.1 芒果苷對肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用

MTT法檢測結果顯示，芒果苷濃度≥25μmol/L能明顯抑制HepG2細胞的增殖，且具有濃度依賴性，所以取芒果苷濃度為50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L用于下一步的實驗（表1）.

表1 芒果苷作用24小時對HepG2細胞增殖的影響（`x±s，n=6）

4.2 芒果苷對肝癌細胞HepG2的遷移及侵襲的抑制作用

劃痕實驗用于觀察細胞的遷移能力，結果如圖1所示，加入芒果苷后，劃痕區(qū)細胞數量明顯減少，且具有濃度依賴性.Transwell小室遷移/侵襲實驗結果顯示，隨著芒果苷濃度的增加，能明顯抑制HepG2細胞的遷移及侵襲能力，且具有濃度依賴性（圖1）.

圖1 芒果苷對HepG2細胞的遷移及侵襲的影響

4.3 芒果苷對肝癌細胞骨架的影響

研究表明，細胞骨架是細胞發(fā)生遷移的基礎，在正常培養(yǎng)的HepG2細胞中，骨架蛋白-肌動蛋白F-actin表達明顯，細胞骨架蛋白-肌動蛋白F-actin構成的微絲面積比較大，加入200μM的芒果苷后，HepG2細胞中由F-actin構成的微絲減少，骨架面積F-actin明顯減少（圖2）.

圖2 芒果苷對HepG2細胞骨架的影響

4.4 芒果苷對肝癌細胞周期的影響

實驗結果表明，芒果苷可以顯著增加G1/G0期細胞，并減少S、G2/M期的細胞，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.01）（圖3）.

圖3 芒果苷對HepG2細胞周期的影響

4.5 芒果苷對HepG2細胞中CyclinD1和MMP9表達的影響

Westen blot檢測結果顯示，芒果苷能明顯抑制HepG2細胞CyclinD1和MMP9蛋白的表達，且具有濃度依賴性（圖4）.

圖4 芒果苷對HepG2細胞CyclinD1和MMP9蛋白表達的影響

5 討論

原發(fā)性肝癌是臨床上一種常見的惡性腫瘤，死亡率及轉移率極高.腫瘤轉移是腫瘤研究領域的瓶頸，癌癥患者死于腫瘤轉移的超過90%［3］.腫瘤轉移是惡性程度提高的標志，也是癌癥治療失敗和患者死亡的主要原因，其分子機制復雜，涉及多步驟、多階段、多基因的變化.各種原因造成細胞表型的改變使腫瘤惡性程度逐漸提高，最終使腫瘤細胞具有從原發(fā)部位脫離并在轉移部位生長的能力，這個過程不僅牽涉到細胞本身的改變，也牽涉到細胞和宿主微環(huán)境的相互作用，其中一個重要過程就是腫瘤細胞對細胞外基質（ECM）的降解，任何可以影響這個過程的因素都可影響腫瘤的侵襲過程［4-5］.蛋白水解酶對于細胞外基質的降解在腫瘤侵襲及遷移中發(fā)揮巨大的作用，MMP-9的作用更是至關重要，其主要功能是降解細胞外基質并重新設置細胞外基質的動態(tài)平衡，進而對腫瘤細胞的侵襲及遷移過程發(fā)揮正面影響［6］.細胞骨架調控網絡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到關鍵的作用，細胞骨架纖維重塑過程需要肌動蛋白（F-actin）參與，F-actin通過改變細胞片狀偽足及絲狀偽足的形成，進而影響細胞遷移和侵襲過程［7］.周期蛋白依賴性激酶（Cy?clin-dependent kinase）Cdk在細胞周期調控中起核心作用，其主要功能為進行啟動、促進和完成細胞周期事件.研究表明：Cdk必須與周期蛋白（CyclinD）結合才有蛋白激酶活性［8-9］.CyclinD1（G1/S-特異性周期蛋白-D1）是調節(jié)細胞從G1/G0期進入S期的周期蛋白，其主要功能是促進細胞由G1期進入S期從而促進細胞增殖過程.

本研究先采用MTT法篩選出無細胞毒性的芒果苷的濃度后，通過劃痕實驗、Transwell小室侵襲/遷移實驗、細胞骨架分析，證實了隨著芒果苷濃度的增加可以明顯抑制肝癌細胞HepG2的侵襲、遷移及與細胞骨架重建.進一步通過western blot證實了隨著芒果苷濃度的升高可以明顯抑制肝癌細胞HepG2中CyclinD1和MMP9蛋白的表達，提示芒果苷可能通過影響細胞周期進程及胞外基質從而抑制腫瘤細胞的侵襲轉移.在今后的研究中，我們將進一步深入研究芒果苷對肝癌的侵襲、轉移能力的影響及作用機制，并且通過體內動物實驗來進一步探究其藥理效應，為腫瘤的臨床治療提供新的思路.