杜軍 任奇杰 王媛 王娟 李勇

摘要：探討結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染Ⅱ型肺泡上皮細胞（Alveolar epithelial typeⅡcells，AECⅡ）的免疫應答過程中，Hedgehog與NF-κB信號通路及炎癥細胞因子的表達變化規(guī)律。利用結核分枝桿菌BCG（Bacillus Calmette-Guérin，BCG，卡介苗，弱毒株）和H37Rv（國際標準強毒株）株分別感染人AECⅡ細胞株A549，利用qPCR和Western blot檢測Hedgehog信號通路以及NF-κB信號通路相關因子和炎癥細胞因子的表達變化。結果表明，H37Rv和BCG感染A549細胞后，Hedgehog信號通路中Shh、Ptch和Gli1與NF-κB信號通路中p-NF-κB mRNA的表達水平升高，同時，伴隨著炎癥細胞因子IL-8和TNF-α mRNA的表達水平也升高。并且，H37Rv感染A549細胞引起信號分子Shh、Ptch、Gli1和NF-κB蛋白的表達水平高于BCG。Mtb感染AECⅡ細胞都能激活Hedgehog信號通路和NF-κB信號通路并促進細胞的炎癥因子分泌，強毒株感染對信號通路的活化強于弱毒株。

關鍵詞：結核分枝桿菌；肺泡上皮細胞；Hedgehog；NF-kappaB；炎癥因子

中圖分類號：S855.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0070-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.017

Abstract： In order to investigate the roles of expression of Hedgehog and NF-κB signaling pathway signal molecules and inflammatory cytokines in the alveolar epithelial typeⅡ cells （AECⅡ） infected with Mycobacterium tuberculosis（Mtb），the human AECⅡ cell line A549 was infected with Bacillus Calmette-Guérin（BCG，attenuated strain） and H37Rv （international standard virulent strain） respectively，and the signal molecules of Hedgehog and NF-κB signaling pathway and inflammatory cytokines in A549 cells of immune response to Mtb was detected by qPCR，and Western blot. The results showed that， the expression of Shh，Ptch and Gli1 in Hedgehog signaling pathway and the phosphorylation of NF-κB in NF-κB signaling pathway was increased in A549 cells when infected with H37Rv and BCG，and at the same time，the expression of IL-8 and TNF-α was also upregulated. And the protein expression of Shh，Ptch，Gli1 and NF-κB in A549 cells infected with H37Rv was higher than that infected with BCG. The Hedgehog and NF-κB signaling pathway could be activated， and the expression of inflammatory cytokines could be promoted in AECⅡ cells when infected with Mtb. The activation level of the both signaling pathway infected with Mtb virulent strain was higher than that of infected with BCG strain.

Key words：Mycobacterium tuberculosis；alveolar epithelial cells；Hedgehog；NF-kappaB；inflammatory cytokines

肺結核（Tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性、消耗性人獸共患傳染病。2014年，全球死于結核病的人數(shù)為150萬，新發(fā)病例近960萬。全球54%的結核病例出現(xiàn)在中國、印度、印度尼西亞、尼日利亞與巴基斯坦等國，WHO估算中國2014年的新發(fā)肺結核人數(shù)為93萬，位居全球第三位。由于人畜結核病的交叉感染以及多耐藥結核菌株的出現(xiàn)，導致結核病的防治難度增大，并且結核病的人獸疫情在世界部分國家和地區(qū)發(fā)病隱患日趨嚴重[1，2]。雖然從Mtb發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已有130多年的歷史，但是結核病的發(fā)病機制與機體免疫調控機理尚未闡明[3]。

在過去20年中，分泌蛋白Shh（sonic hedgehog）被認為是一種調節(jié)胚胎發(fā)育及氣道和肺泡隔室組織中上皮-間質細胞相互轉化的關鍵因子[4]。近年來對于Shh信號通路在機體免疫調節(jié)方面的關注程度越來越高，其在機體免疫反應中的作用也備受關注，越來越多的證據(jù)證明在許多成年個體的肺部疾病如肺纖維化、哮喘、肺癌及慢性肺部炎癥疾病中都有Shh信號的激活[5，6]。在Mtb感染細胞時Shh信號通路會被激活，但是對強弱毒株感染細胞時Shh信號通路的表達變化尚缺乏系統(tǒng)的研究。另一方面，NF-κB作為一類重要的核轉錄因子，可調控細胞對不同外界刺激做出合適的細胞信號應答，這種調控作用依賴NF-κB與多種信號通路相互鏈接的上下游協(xié)同作用，NF-κB信號通路與Shh信號通路有關聯(lián)[7]。為此，試驗將基于以上研究結果，用Mtb感染AECⅡ細胞，分析Hedgehog和NF-κB信號通路相關因子及炎性因子的表達變化，探究在AECⅡ細胞受到Mtb感染時Hedgehog和NF-κB信號通路及其在細胞的炎癥應答過程中的變化規(guī)律，旨在為揭示結核病的發(fā)病機理和防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞 卡介苗（BCG），購自成都生物制品研究所；結核分枝桿菌強毒株（H37Rv），由寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院檢驗室提供；人肺泡Ⅱ型上皮細胞系A549細胞，購自中國科學院北京協(xié)和細胞庫。

1.1.2 主要試驗試劑 RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清和SuperSignal West Pico Trial Kit（Thermo），Trizol（Invitrogen），反轉錄試劑盒（Promega），Real Time PCR試劑盒（Qiagen），考馬斯G-250和Tween-80（Sigma），Middlebrook 7H9（BD），6×Protein Loading Buffer（全式金），Acr-Bis 30%和Tris-HCl Buffer（上海百賽），改良羅氏培養(yǎng)基（青島海博），Western BrightTM ECL（Advansta），全面蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒（凱基），ELISA試劑盒（欣博盛），Shh（CST，CST#2207），p-NF-κB（CST，CST#3033），Ptch（Proteintech，17520-1-AP），Gli1（Proteintech，25733-1-AP），β-actin（中山金橋， TA-09），羊抗兔IgG-HRP（中山金橋，ZB-2301），山羊抗小鼠IgG-HRP（中山金橋，ZB-2305），Middlebrook OADC Enrichment（BD）等。

1.1.3 引物 試驗所使用熒光定量PCR的引物按照熒光定量PCR引物設計原則進行設計，并在Invitrogen公司合成，詳見表1。

1.2 BCGD毒株和H37Rv的培養(yǎng)

挑取健康的BCG和H37Rv單菌落菌株接種于BD 7H9液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～4周后，可觀察到菌體生長導致的培養(yǎng)基渾濁現(xiàn)象。

BD 7H9液體培養(yǎng)基配方為0.47 g BD 7H9+89.8 mL ddH2O+0.2 mL Tween-80，121 ℃ 高壓滅菌30 min，使用前加入10 mL Middlebrook OADC Enrichment，混勻、分裝。

1.3 BCG和H37Rv感染A549細胞

用胰酶消化A549細胞，用RPIM 1640完全培養(yǎng)基稀釋成2.5×105個/mL的細胞懸液，2 mL/孔接種于六孔細胞培養(yǎng)板，體積分數(shù)5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)；當A549細胞匯合率達到60%時換培養(yǎng)液，用1640完全培養(yǎng)液重懸BCG和H37Rv，以感染復數(shù)MOI（multiplicity of infection，細菌數(shù)與細胞數(shù)的比例）10∶1分別進行感染，同時，設空白對照。

1.4 Realtime-qPCR檢測Hedgehog和NF-κB信號通路相關分子及炎癥細胞因子在mRNA水平的表達變化

用BCG和H37Rv感染的A549細胞24 h后收集細胞并提取總RNA，反轉錄并利用熒光定量PCR技術檢測Hedgehog和NF-κB信號通路中相關分子和炎癥細胞因子的表達情況（表1）；按照Trizol試劑說明書裂解細胞提取mRNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用Nanodrop 1000（Thermo）紫外分光光度計測定RNA濃度和純度；參考Promega反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄PCR；參照天根公司的熒光定量PCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR檢測。

1.5 Western Blot檢測Hedgehog和NF-κB信號通路中相關因子在蛋白水平的變化

按照全蛋白提取試劑盒說明書（凱基）提取細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行定量；進行SDS-PAGE，每孔蛋白上樣量為20～30 μg，電壓80 V。將SDS-PAGE結果40 mA恒定電流轉膜過夜；將PVDF膜放入雜交盒并加入封閉液15 mL，室溫，勻速搖床上緩慢搖動封閉1 h；倒掉封閉液，加入稀釋好的一抗，4 ℃下在搖床上緩慢搖動孵育一晚；次日用15 mL的TBST緩沖液洗膜，每次搖動洗滌10 min，共洗3次；將二抗按1∶1 000（二抗：5%BSA溶液）的比例稀釋加入，室溫下?lián)u動1～2 h后用15 mL的TBST緩沖液洗膜3次；用PBS漂洗2次，將配制的ECL顯色液滴加到PVDF膜上，室溫反應5 min，用保鮮膜包裹并放入暗盒，曝光洗片。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差（x±SD）表示，采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用LSD檢驗對各組進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 細胞總mRNA的提取

對提取的細胞總mRNA進行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結果（圖1）表明，試驗提取的mRNA 28S、18S、5.8S條帶完整，可用于后續(xù)的反轉錄試驗和RT-qPCR試驗。

2.2 Mtb感染A549細胞Hedgehog和NF-κB信號通路相關分子及炎癥細胞因子mRNA的表達變化

當BCG毒株感染A549細胞24 h時，促進了Hedgehog信號通路中Shh、Gli1和Gli2的表達，抑制了Ptch和Smo的表達（圖2A），表明BCG感染促進了Hedgehog信號通路的活化。在NF-κB信號通路中，BCG毒株感染抑制了TLR2、TLR4和NF-κB的表達而促進了MyD88和炎癥細胞因子IL-8和TNF-α的表達，抑制了IL-6和IL-12A的表達（圖2B、圖2C），這可能是因為弱毒株BCG感染引起較弱的炎癥反應，且炎癥反應不依賴于TLR2/TLR4的活化。

當強毒株H37Rv感染A549細胞24 h時，促進了Hedgehog信號通路中Gli1和Gli2的表達，同時也促進了NF-κB信號通路中TLR2/TLR4的表達，并顯著促進了炎癥細胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達，對MyD88和IL-12A的表達有一定抑制作用（圖2A、圖2B、圖2C），表明H37Rv感染能激活Hedgehog信號通路并引起A549細胞較強的炎癥細胞因子分泌。結果中還發(fā)現(xiàn)，H37Rv毒株感染引起Shh的表達低于BCG毒株感染，而Ptch、Gli1、Gli2、TLR2/TLR4和NF-κB以及炎癥細胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達都高于BCG感染組。這些結果表明，H37Rv和BCG毒株感染都能激活Hedgehog信號通路并促進細胞的炎癥反應，并且H37Rv毒株感染引起的炎癥反應強于BCG毒株感染。

2.3 Mtb感染A549細胞Hedgehog和NF-κB信號通路相關分子的蛋白表達變化

BCG感染A549細胞24 h時，促進了Shh信號通路中Shh、Ptch和Gli1蛋白的表達，這些結果與mRNA表達一致；p-NF-κB表達水平也升高，這與NF-κB mRNA的表達不一致，可能是BCG感染促進了胞漿中NF-κB的活化（圖3A、圖3E）。H37Rv感染組A549細胞24 h時，促進了Ptch、Gli1和p-NF-κB的表達，H37Rv感染A549細胞引起Gli1和p-NF-κB的表達水平都高于BCG感染組（圖3A、圖3B、圖3C、圖3D）。這些結果表明，BCG和H37Rv感染都促進了Hedgehog信號通路和NF-κB信號通路的活化，且H37Rv感染對Hedgehog信號通路和NF-κB信號通路的活化程度高于BCG感染。

3 小結與討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)在機體受到外源微生物入侵時，Hedgehog信號通路和NF-κB信號通路等通過調控巨噬細胞、AECⅡ細胞等具有免疫調控功能的細胞，在不同程度上參與了機體的炎性應答[8，9]。當機體的組織或細胞受到感染性因素或腫瘤性因素侵襲時，由于外界刺激及壓力脅迫會引起機體的免疫調控和炎性反應，發(fā)育相關的Hedgehog信號通路此時也參與了機體免疫應答的調控和炎癥反應[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb感染A549細胞可激活細胞內Hedgehog信號通路，促進細胞的炎癥反應和細胞存活[13]。NF-κB是一類重要的轉錄因子，其活化可激活下游眾多的細胞因子的轉錄，在機體對抗外源微生物侵染時調控機體的免疫反應[14]。本試驗結果表明，在Mtb感染A549細胞后，能促進Shh信號通路中Shh、Ptch和Gli1的表達，這表明Mtb感染機體能激活Hedgehog信號通路。

試驗結果表明，在Mtb感染AECⅡ細胞時，雖然NF-κB在mRNA水平表達下調，但是在蛋白質水平p-NF-κB的表達水平顯著上調，這是因為NF-κB是以活化形式，即磷酸化形式（p-NF-κB）在細胞免疫應答過程中發(fā)揮調控作用[15-17]。同時發(fā)現(xiàn)，H37Rv感染對Hedgehog信號通路和NF-κB信號通路的激活作用弱于BCG感染。

IL-6可以誘導B細胞的分化，增強NK細胞的活性，抑制細胞凋亡，增強造血干細胞分化等[18]，TNF-α又叫腫瘤壞死因子，能促進T細胞產(chǎn)生各種炎性因子并促進炎癥應答[19]。試驗中，BCG毒株感染AECⅡ細胞促進了IL-8的表達，而抑制IL-6和TNF-α的表達，這種促進作用可以加強BCG毒株對機體的保護作用[20]，這與相關研究結果一致[21]。

試驗中發(fā)現(xiàn)，H37Rv感染AECⅡ細胞引起的炎癥反應強于BCG感染，這進而證實了Mtb強毒株感染可引起機體細胞較強的炎癥反應和壞死，而弱毒株引起弱的炎癥反應并通過免疫應答保護機體抵抗Mtb感染[22-25]。同樣有研究表明，BCG和H37Rv感染肺泡上皮細胞后僅H37Rv毒株產(chǎn)生細胞毒性[26]。這些結果為進一步研究Mtb感染AECⅡ細胞時的免疫調控作用提供理論依據(jù)。

H37Rv和BCG毒株感染都能激活Hedgehog信號通路和NF-κB信號通路，并且H37Rv感染對兩種信號通路的表達促進作用弱于BCG毒株感染組。H37Rv感染組和BCG感染組都能促進細胞的炎癥細胞因子表達，并且H37Rv毒株感染引起炎癥細胞因子的表達作用強于BCG毒株感染組。

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