袁　捷，陳　靜

(1.吉安市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西 吉安 343000；2.吉安市白塘街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心婦產(chǎn)科，江西 吉安 343000)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占卵巢癌的60%左右，其發(fā)病率和死亡率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[1]。由于EOC早期階段(Ⅰ～Ⅱ期)無典型的臨床表觀，大多數(shù)患者確診時已發(fā)展至晚期階段，這也是EOC高死亡率的主要原因[2-3]。目前，臨床上對EOC的早期診斷主要借助于常規(guī)超聲篩查及血清CA125檢測等手段，但因CA125敏感性和特異性低，導致診斷假陰率較高，聯(lián)合超聲檢測陽性診斷率也低于20%[4]。晚期EOC患者5 a死亡率約為早期患者的3倍，高達70%～80%，且EOC的發(fā)病率和死亡率正呈逐年上升趨勢[5-6]。因此，越來越多的專家和學者正致力于研究一種高敏感性和特異性的新型EOC早期診斷方法。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)可能是一類與精子成熟相關(guān)的蛋白酶抑制劑，功能尚不清楚。HE4基因表達與卵巢癌相關(guān)，因其可作為EOC診斷的一類特異性腫瘤標志物而引起廣泛重視和研究[3-4]。目前，國內(nèi)外針對HE4與EOC早期診斷方面的研究主要集中于血清學方面，而關(guān)于卵巢組織中特異性表達HE4的研究相對較少。本研究通過檢測患者血清HE4水平，同時結(jié)合實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)方法探討卵巢組織中HE4基因表達情況與血清HE4水平之間的關(guān)系，這將為HE4在EOC早期診斷中的應用提供實驗依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料收集我院及江蘇省人民醫(yī)院于2013年3月至2016年3月期間經(jīng)病理學檢查確診為EOC的患者100例(EOC組)，年齡20～69(51.17±12.28)歲；早期(Ⅰ～Ⅱ期)EOC患者44例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)EOC患者56例；組織學類型：漿液性腺癌43例，黏液性腺癌57例；組織分化程度：中、低分化73例，高分化27例。選取同期收治的良性卵巢腫瘤患者35例(良性對照組)和卵巢非腫瘤性疾病患者30例(正常對照組)。良性對照組患者年齡23～68(52.52±14.25)歲。正常對照組患者年齡24～63(51.25±15.27)歲。收集患者年齡、FIGO分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料，其中部分EOC患者和卵巢非腫瘤性疾病患者信息樣本由江蘇省人民醫(yī)院收集。其中正常對照組標本取自絕經(jīng)宮頸癌患者手術(shù)治療同期切除的正常卵巢組織，良性對照組標本取自卵巢囊腫和肌瘤患者手術(shù)切除的良性卵巢腫瘤組織。入組患者排除重癥內(nèi)科疾病，既往無其他惡性腫瘤史，首次治療切除卵巢組織前均未接受放療或化療。

1.2實驗試劑與儀器HE4定量檢測試劑盒(電化學發(fā)光法)和全自動免疫分析儀均購自德國Roch公司。RNA提取試劑盒購自美國Promega公司，上下游引物由美國Invitrogen公司合成，一步法qPCR試劑盒和Smart SpecTMPlus核酸蛋白測定儀均購自美國Bio-Rad公司。高速組織勻漿機購自德國IKA公司。Step One PlusTM實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司。

1.3電化學發(fā)光法檢測血清HE4水平所有患者于住院治療期間進行空腹靜脈采血，血液樣本在4 h內(nèi)離心分離，收集血清放于-80 ℃冰箱保存。行化學發(fā)光前，所有樣本低溫解凍，并按檢測試劑盒和儀器操作步驟進行。樣本溶解后于4 ℃低溫保藏，并于48 h內(nèi)進行檢測。HE4的電化學發(fā)光檢測項目參考范圍為0～140 pmol·L-1，>140 pmol·L-1則記為陽性。

1.4qPCR檢測HE4mRNA表達卵巢組織經(jīng)高速組織勻漿機低溫勻漿并提取組織RNA，應用核酸定量儀定量后控制RNA濃度在2.0 μg·L-1。一步法qPCR擴增體系配制如下：RNA模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR?Green Mix 10 μL，iScript逆轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL，無核酶水6.95 μL，總體系為20 μL。程序設(shè)定如下：50 ℃，10 min行逆轉(zhuǎn)錄反應，95 ℃，60 s預變性；95 ℃，15 s變性，60 ℃，60 s退火，共36個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認設(shè)置，數(shù)據(jù)處理方法采用2-ΔΔCT相對定量法。

2　結(jié)果

2.1各組患者血清HE4陽性率比較各組患者血清HE4陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常對照組、良性對照組和EOC組患者血清HE4陽性率分別為0.00%(0/30)、17.14%(6/35)和75.00%(75/100)，EOC組的陽性率明顯高于正常對照組和良性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1　各組患者血清HE4陽性率比較

2.2EOC患者血清HE4陽性率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系晚期患者HE4陽性率顯著高于早期患者(P<0.05)。中、低分化患者HE4陽性率顯著高于高分化患者(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HE4陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表2。

表2　EOC患者血清HE4陽性率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3各組患者卵巢組織中HE4mRNA的表達情況比較各組患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EOC組患者卵巢組織中HE4 mRNA表達水平明顯高于正常對照組和良性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3　各組患者卵巢組織中HE4 mRNA表達的比較

2.4EOC患者卵巢組織中HE4mRNA的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系與早期患者相比，晚期患者卵巢組織中HE4 mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.05)。中、低分化患者HE4 mRNA水平顯著高于高分化患者(P<0.05)。同時，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者HE4 mRNA水平也均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。但卵巢組織中HE4 mRNA的表達均與患者年齡和組織分型無關(guān)(P>0.05)。見表4。

表4　EOC患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3　討論

目前，臨床上常規(guī)借助CA125聯(lián)合超聲篩查等手段用于EOC早期診斷，但CA125存在敏感性差和組織特異性低等制約因素[4]。研究[4]顯示，在EOC患者中，約20%的群體不表達或低表達CA125，且我院往期收治患者中也出現(xiàn)部分CA125假陽性結(jié)果，往往因患者存在個體差異及良性腫瘤等影響因素，導致常規(guī)診斷手段的EOC診斷率較低。本文所研究的HE4是一類與生殖相關(guān)的蛋白酶抑制劑類物質(zhì)，其本質(zhì)上是一種分泌型糖蛋白，但生物學功能目前尚不清楚[7-8]。已有研究[9]證實HE4與卵巢癌病理生理過程相關(guān)。本研究檢測患者血清中的HE4水平后發(fā)現(xiàn)，EOC患者血清中HE4陽性率顯著高于良性對照組和正常對照組，表明EOC患者體內(nèi)高表達和分泌HE4。尤其在正常對照組中無HE4陽性患者，良性對照組HE4陽性率也未超過20%，這進一步提示患者血清中HE4水平變化可能與卵巢組織癌變有關(guān)。

由于HE4是一種分泌型糖蛋白，不利于組織原位檢測[7-8]。因此，為了進一步探討患者血清HE4水平與卵巢癌變之間的可能性關(guān)系，本研究利用qPCR方法檢測了3組患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達變化，結(jié)果顯示EOC患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達顯著高于卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織，表明卵巢癌變可引起組織中HE4 mRNA表達上調(diào)，這也與HE4在卵巢癌細胞系中高表達的研究結(jié)果相一致[10]。有研究[11]顯示，HE4在人體正常卵巢組織中不表達或低表達，結(jié)合血清HE4檢測結(jié)果，進一步提示卵巢癌變導致組織中的HE4 mRNA表達上調(diào)，可能進一步促進了HE4蛋白的合成和分泌過程。

從EOC患者血清HE4水平和mRNA檢測結(jié)果與臨床病理參數(shù)的關(guān)系可以看出，以上HE4檢測指標均與臨床分期、細胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，這進一步說明HE4在EOC的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演一定的角色。同時，HE4具有較強的組織特異性，可彌補常規(guī)CA125篩查導致的假陰性較高缺陷，因此推測HE4檢測指標可用于EOC的篩查和診斷。

本研究結(jié)合qPCR等分子生物學方法，探討了血清HE4與卵巢組織中HE4基因表達的可能性關(guān)系，這為研究HE4在EOC組織中特異性表達及血清HE4檢測指標用于EOC的早期診斷等方面提供了實驗依據(jù)。