徐　磊，孫志超

(連云港市第二人民醫(yī)院病理科，江蘇 連云港 222002)

結(jié)腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，全球每年約有120萬人發(fā)病，根據(jù)我國11個腫瘤登記處的調(diào)查結(jié)果，其發(fā)病率在惡性腫瘤中占第5位[1]，隨著我國人口老齡化的到來，老年結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢。腫瘤干細(xì)胞對腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用。CD133被確認(rèn)是較特異的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，Kim等[2]研究發(fā)現(xiàn)CD133是結(jié)腸癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志物。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是Zn2+依賴性內(nèi)肽酶蛋白水解酶家族,可降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種膠原成分。MMP-2是MMPs家族中的一員，其作用底物為Ⅳ型膠原，通過對Ⅳ型膠原、層粘連蛋白的降解功能，促進了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。本文擬對CD133、MMP-2在老年結(jié)腸癌組織中表達(dá)情況與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系進行初步研究，探討兩者在老年結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。

1　資料與方法

1.1一般資料選取我院行根治性切除的老年結(jié)腸癌患者進行回顧性研究，納入有完整病理學(xué)資料和隨訪資料的患者，排除結(jié)腸癌復(fù)發(fā)再次手術(shù)者、炎性腸病者、合并其他部位非結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移性癌者。所有入選患者均未接受過治療，術(shù)后生存時間均大于3個月，共有67例老年結(jié)腸癌患者納入本研究。結(jié)腸癌分期參照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期，組織學(xué)類型均為結(jié)腸腺癌，并取其中10例距離癌組織10 cm以上的正常腸黏膜組織作為對照。67例老年結(jié)腸癌患者中，男30例，女37例；中位年齡69(60～82)歲；腫瘤≥5 cm共47例，<5 cm共20例；高分化和中分化腺癌共48例，低分化腺癌19例；腫瘤侵犯淺、深肌層21例，累及全層及漿膜外46例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；UICC分期為Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期37例。所有入選患者隨訪不少于5 a，只有確定為術(shù)后因結(jié)腸癌死亡者視為隨訪結(jié)束，隨訪中斷的視為刪失，中位隨訪時間為43個月。

1.2試劑兔抗人CD133單克隆抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人MMP-2單克隆抗體、S-P試劑盒、DAB顯色液均購自上海長島生物技術(shù)有限公司，其中MMP-2為濃縮型抗體，工作濃度為150。

1.3方法由2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生閱片確診，所有標(biāo)本均經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液固定(pH值7.0)，石蠟包埋，以厚度4 μm進行連續(xù)切片、烤干；將各切片在37 ℃恒溫箱內(nèi)過夜預(yù)溫；二甲苯脫蠟；酒精水化；蒸餾水沖洗；微波抗原修復(fù)；蒸餾水新鮮配制體積分?jǐn)?shù)3% H2O2，室溫孵育15 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；滴加正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min；滴加抗體；滴加DAB顯色液，鏡下控制反應(yīng)時間；沖洗；復(fù)染；分化；封片。采用切片組織染色后自身內(nèi)對照作為陽性對照，采用PBS代替一抗孵育切片組織后的染色作為陰性對照。

1.4結(jié)果判定CD133主要表達(dá)于細(xì)胞膜，MMP-2表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜, 以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性染色。由2位病理科醫(yī)生進行雙盲法閱片，分別計數(shù)10個隨機高倍鏡(×400)視野下的陽性細(xì)胞率，并取平均值。CD133、MMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞率≥10%為陽性，未見黃染顆粒的細(xì)胞或無論染色深淺每高倍視野細(xì)胞陽性率<10%為陰性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 22.0 行統(tǒng)計學(xué)處理，CD133和MMP-2的表達(dá)與老年結(jié)腸癌臨床病理特征間的關(guān)系行χ2檢驗, 生存分析用Kaplan-Meier法, CD133和MMP-2的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1老年結(jié)腸癌組織中CD133表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系67例老年結(jié)腸癌組織中CD133的陽性表達(dá)率為58.2%(39/67)，而10例正常結(jié)腸黏膜組織中未見CD133的表達(dá)。老年結(jié)腸癌組織中CD133的表達(dá)與患者性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、侵犯層次均無關(guān)(P>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期有關(guān)(P=0.004、0.007)。見表1。

2.2老年結(jié)腸癌組織中MMP-2表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系67例老年結(jié)腸癌組織中MMP-2的陽性表達(dá)率為70.1%(47/67)，而10例正常結(jié)腸黏膜組織中未見MMP-2的表達(dá)。老年結(jié)腸癌組織中MMP-2的表達(dá)與患者的性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度均無關(guān)(P>0.05)，而與侵犯層次、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期有關(guān)(P=0.032、0.004、0.030)。見表1。

2.3老年結(jié)腸癌組織中CD133和MMP-2表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，老年結(jié)腸癌組織中CD133的表達(dá)和MMP-2的表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=0.042，P=0.733)。見表2。

2.4CD133和MMP-2的表達(dá)與老年結(jié)腸癌患者術(shù)后5a生存率的關(guān)系CD133陽性表達(dá)患者5 a生存率26.9%，CD133陰性表達(dá)患者5 a生存率64.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030)。MMP-2陽性表達(dá)患者5 a生存率32.3%，MMP-2陰性表達(dá)患者5 a生存率80.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.046)。

表1　老年結(jié)腸癌組織中CD133和MMP-2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表2　老年結(jié)腸癌組織中CD133和MMP-2蛋白表達(dá)的相互關(guān)系

注：r=0.042,P=0.733

3　討論

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，術(shù)后5 a生存率約40%～70%，老年結(jié)腸癌是結(jié)腸癌患者中的一個主要患者群體，老年患者機體逐漸老化，免疫功能逐漸減弱[4]。老年人結(jié)腸癌發(fā)病率增加，且老年結(jié)腸癌的臨床表現(xiàn)、病理特征與非老年患者不同，主要表現(xiàn)為：癥狀不典型；右側(cè)大腸癌多見；組織學(xué)分化良好者多見。因此，老年結(jié)腸癌患者可作為獨立的研究群體。本研究對CD133和MMP-2在老年結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況進行初步觀察，探討兩者對老年結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響。

腫瘤中存在的腫瘤干細(xì)胞參與并控制了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞是具有惡性增殖能力、自我更新能力以及多向分化潛能的細(xì)胞，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移均具有促進作用。CD133是一個含有865個氨基酸、相對分子質(zhì)量約為120 000的糖蛋白，在多種腫瘤的研究[5]中發(fā)現(xiàn)，CD133陽性細(xì)胞具有自我更新、分化和高致瘤性等干細(xì)胞特性，因此CD133可作為結(jié)腸癌干細(xì)胞的標(biāo)志物。另外，實驗[6]證實CD133陽性細(xì)胞表達(dá)高水平的多藥耐藥基因，具有很強的藥物抗性及DNA損傷修復(fù)能力，因此對化療藥物具有很強的抵抗能力。研究[7]發(fā)現(xiàn)CD133陽性表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞對腫瘤發(fā)展起到促進作用，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，是判斷結(jié)腸癌預(yù)后的參考指標(biāo)。Fang等[8]報道CD133陽性表達(dá)的結(jié)腸癌患者生存時間較短，且CD133是結(jié)腸癌的獨立預(yù)后因素，因此CD133表達(dá)可能成為影響結(jié)腸癌患者生存時間的重要因素，CD133已經(jīng)成為結(jié)腸癌靶向治療的新靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，67例老年結(jié)腸癌組織中CD133陽性表達(dá)39例，陽性表達(dá)率為58.2%，10例正常腸黏膜組織中未檢測到CD133表達(dá)，CD133在老年結(jié)腸癌組織中表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期顯著相關(guān)， CD133陽性表達(dá)的老年結(jié)腸癌患者，腫瘤的侵襲能力強，惡性程度高，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大，患者的術(shù)后生存時間短。這提示CD133陽性的腫瘤組織中含有更多的腫瘤干細(xì)胞，CD133陽性細(xì)胞在老年結(jié)腸癌組織中的表達(dá)在一定程度上能預(yù)示老年結(jié)腸癌的惡性程度及預(yù)后。

腫瘤細(xì)胞異常增殖的同時會分泌MMPs，MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種膠原成分, 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的一類蛋白水解酶。MMPs包括多種具有同源性結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)，其中MMP-2、MMP-9研究較為廣泛。MMP-2是MMPs家族中最常見也是最重要的一種，當(dāng)細(xì)胞惡變時，常伴有MMP-2的升高，MMP-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各型膠原和基底膜，從而促進腫瘤細(xì)胞向周圍組織擴散；MMP-2還可以釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等，誘導(dǎo)腫瘤血管生成；MMP-2還有調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附的能力，降低腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的黏附力，使之更易脫落，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9-10]。研究[3]表明，幾乎各類腫瘤細(xì)胞都存在MMP-2高表達(dá)，結(jié)腸癌組織中的MMP-2也明顯高于正常結(jié)腸黏膜，通過上述機制，MMP-2可促進結(jié)腸癌細(xì)胞的快速增殖及擴散，從而嚴(yán)重影響結(jié)腸癌患者的生存時間。本文結(jié)果顯示，67例老年結(jié)腸癌組織中MMP-2陽性表達(dá)47例，陽性率為70.1%，10例正常腸黏膜組織中未檢測到MMP-2表達(dá)，MMP-2在老年結(jié)腸癌組織中表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期顯著相關(guān)，同時與腫瘤侵犯層次密切相關(guān)，這與有關(guān)文獻[11]一致, MMP-2陽性表達(dá)的細(xì)胞對腫瘤的進展起促進作用，使腫瘤細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)的能力明顯增強，有利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，故MMP-2可作為一個反映老年結(jié)腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性行為的重要指標(biāo)。

總之，CD133和MMP-2均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期相關(guān)，且經(jīng)Kaplan-Meier生存分析，兩者陽性表達(dá)的老年結(jié)腸癌患者預(yù)后均較差，這說明CD133和MMP-2在老年結(jié)腸癌的發(fā)展過程中起到了促進作用，檢測CD133和MMP-2均可作為判斷老年結(jié)腸癌惡性程度及預(yù)后的參考指標(biāo)。