葉雪挺 陳洪德 翁志梁

間質(zhì)性膀胱炎（IC）臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，儲(chǔ)尿期癥狀較重的患者常伴隨膀胱有效容量的降低，可能與膀胱纖維化及低順應(yīng)性膀胱的形成相關(guān)。有研究認(rèn)為［1］在膀胱纖維化過程中，組織中膠原蛋白特別是Ⅰ型膠原蛋白合成增加。有研究表明，RhoA/Rho激酶在人類和動(dòng)物的膀胱平滑肌功能與結(jié)構(gòu)方面起重要調(diào)節(jié)作用［2］。前期研究［3］顯示在IC大鼠模型中RhoA/Rho激酶途徑可能增加膀胱逼尿肌收縮的敏感性，從而參與IC的發(fā)生、發(fā)展。且Rho激酶可能參與調(diào)控心肌的纖維化［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道［5］RhoA /Rho激酶通路與小鼠左心室重構(gòu)有關(guān)，Rho激酶可促進(jìn)小鼠心肌纖維化，長(zhǎng)期抑制Rho激酶可顯著改善心室重構(gòu)。本文探討IC患者膀胱平滑肌組織中RhoA/Rho激酶、I型膠原表達(dá)情況及相關(guān)性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2012年10月至2016年12月本院IC患者24例（觀察組），其中男5例，女19例；平均年齡（49.3±11.4）歲。平均病程（74.6±16.4）個(gè)月。診斷符合美國(guó)糖尿病、消化及腎病協(xié)會(huì)（NIDDK）制定的IC診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。排除糖尿病、高血壓、精神病史、肝腎功能損害、膀胱相關(guān)感染性、免疫性疾病。根據(jù)盆腔疼痛和尿頻、尿急患者癥狀調(diào)查表評(píng)分（PUF評(píng)分），≤15分12例為低癥狀評(píng)分組；PUF評(píng)分＞15分12例為高癥狀評(píng)分組。另收集同期12例輸尿管膀胱再植手術(shù)患者正常膀胱組織為對(duì)照組，其中男2例，女10例，平均年齡（50.4±12.8）歲。與觀察組比較年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），所有入選患者均知情同意。

1.2 方法 （1）標(biāo)本采集：觀察組硬脊膜外麻醉下行膀胱注水?dāng)U張時(shí)取膀胱組織活檢，活檢部位遠(yuǎn)離潰瘍處。對(duì)照組為所取正常膀胱組織。將所取膀胱組織修剪為0.5cm×0.5cm×0.5cm的平滑肌組織，用生理鹽水沖洗后放入凍存管，迅速轉(zhuǎn)移至液氮內(nèi)保存。（2）試劑及設(shè)備： TRIzol總RNA抽提試劑盒：美國(guó)MRC公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國(guó)Promega公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒：美國(guó)Promega公司，Rotor-Gene 3000實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀：澳大利亞Corbett Research公司。人Ⅰ型膠原蛋白、RHoA蛋白、ROCK I蛋白ELISA試劑盒：美國(guó)TSZ公司。PBS緩沖液：北京中杉生物技術(shù)公司。ELX800酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek公 司。（3）RT-PCR檢 測(cè) RhoA mRNA、ROCK I mRNA水平：①總RNA提?。喊螂灼交〗M織按照TRIzol提取總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定純度。②合成DNA：按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作合成，RhoA上游引物為5'-CTGGTTGGGAATAAGAAGGAT-3'，下 游 引 物 為5'-CAGCAAGGTTTCACAAGACA-3'，產(chǎn) 物 大 小253bp；ROCK I上 游 引 物 為5'-AACTGATGGTAACCTCCCAGAGT-3'， 下 游引 物 為5'-GGATTGCTCCTTATCTTGTTCG-3'，產(chǎn) 物 大 小 159bp。β-actin上 游 引 物 為5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'，下游引物為5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'，產(chǎn)物大小 211bp。③分別擴(kuò)增RhoA、ROCK I與β-actin：94℃變性

1min，52℃退火45s，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。每一反應(yīng)至少重復(fù)進(jìn)行3次。④標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別取各組逆轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板，以10倍濃度梯度稀釋后分別行PCR反應(yīng)。分析擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)，獲取溶解曲線及定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑤結(jié)果判斷：根據(jù)Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取待測(cè)基因表達(dá)水平，并以此表達(dá)水平與參照物表達(dá)水平之比作為樣品中待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平。（4）ELISA法測(cè)定RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白含量：稱取膀胱平滑肌組織500mg，勻漿后將勻漿物于4℃，12000r/min離心10min。分別收集上清液-70℃冰箱保存，用于標(biāo)本含量測(cè)定。檢測(cè)操作步驟嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用酶標(biāo)儀于450nm處讀取OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)樣本RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，Levene檢驗(yàn)法檢驗(yàn)各總體方差齊性，方差不齊時(shí)采用Welch法進(jìn)行校正。方差齊時(shí)各組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)各組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組間RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。三組間RhoA mRNA兩兩比較顯示對(duì)照組與低癥狀評(píng)分組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.093），高癥狀評(píng)分組與對(duì)照組、低癥狀評(píng)分組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。ROCK I mRNA兩兩比較顯示對(duì)照組與低癥狀評(píng)分組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.590），高癥狀評(píng)分組與對(duì)照組、低癥狀評(píng)分組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。采用Pearson相關(guān)分析法計(jì)算RhoA mRNA與ROCK I mRNA 的相關(guān)系數(shù) r=0.590（P＜0.01），RHoA 蛋白與ROCK I蛋白的相關(guān)系數(shù)r=0.737（P＜0.01），RHoA蛋白與Ⅰ型膠原蛋白的相關(guān)系數(shù)r=0.783（P＜0.01），ROCK I蛋白與Ⅰ型膠原蛋白的相關(guān)系數(shù)r=0.736（P＜0.01）。

表1 三組RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平（x±s）

3 討論

IC的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，臨床癥狀復(fù)雜多樣，尿頻、尿急、盆腔痛及夜尿增多等癥狀較常見。臨床上部分癥狀較重的患者行尿動(dòng)力學(xué)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)膀胱順應(yīng)性降低，膀胱最大容量減小的現(xiàn)象［7］，推測(cè)與膀胱纖維化有關(guān)。上述現(xiàn)象的出現(xiàn)，用目前被多數(shù)學(xué)者接受的膀胱上皮通透性異常假說(shuō)尚難以解釋。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)［8］RhoA/Rho激酶途徑在調(diào)節(jié)大鼠及人類膀胱逼尿肌收縮中起重要作用。當(dāng)細(xì)胞接受到信號(hào)刺激時(shí)，激活胞質(zhì)內(nèi)的RhoA，進(jìn)而激活其下游的Rho激酶。Rho激酶又稱為Rho相關(guān)激酶（ROCK），是RhoA下游最主要 、最具特色的效應(yīng)器［9］，存在著多種磷酸化和去磷酸化的作用，有ROCK I和ROCK II兩個(gè)亞型，研究［10］表明，在內(nèi)臟平滑肌組織中主要起作用的是ROCK I。ROCK I激活后可抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）活性，提高肌球蛋白ATP酶的活性，改變調(diào)節(jié)性蛋白對(duì)鈣離子的敏感性，增強(qiáng)平滑肌的收縮敏感性［11］。除此以外，ROCK I激活后還可以通過抑制一氧化氮的產(chǎn)生、抑制神經(jīng)血管再修復(fù)等可能途徑導(dǎo)致膀胱過度活動(dòng)［12］。

膀胱平滑肌組織纖維化是膀胱功能由代償向失代償轉(zhuǎn)變的重要過程。近年來(lái)有研究［13］表明，RhoA/Rho激酶途徑與心肌纖維化相關(guān)。小分子Rho酶家族除增加平滑肌細(xì)胞收縮敏感性外，也可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、聚集、粘附、增殖等功能。有研究發(fā)現(xiàn)［4］，Rho激酶可能參與調(diào)控大鼠心肌肥厚與血管平滑肌肥大，另有文獻(xiàn)［5］指出RhoA/Rho激酶途徑與小鼠心血管重構(gòu)及心肌梗死后的左心室重構(gòu)有關(guān)，特異性抑制劑抑制Rho激酶后可改善重構(gòu)程度。應(yīng)用基因敲除技術(shù)，有研究［14］認(rèn)為Rho激酶的同源異構(gòu)體形式ROCK1在心肌纖維化中起重要作用。根據(jù)以上研究結(jié)果，作者推測(cè)RhoA/Rho激酶途徑可能與IC疾病進(jìn)展過程中的膀胱纖維化相關(guān)。本資料結(jié)果顯示，對(duì)照組、低癥狀評(píng)分組、高癥狀評(píng)分組組間RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平均有顯著性差異，RhoA mRNA與ROCK I mRNA、RHoA蛋白與ROCK I蛋白、RHoA蛋白與Ⅰ型膠原蛋白、ROCK I蛋白與Ⅰ型膠原蛋白間均存在正相關(guān)。提示IC患者存在膀胱平滑肌組織纖維化現(xiàn)象，且纖維化程度與臨床癥狀水平相關(guān)，臨床癥狀水平越高，纖維化程度也越重。在纖維化過程中明顯上調(diào)RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白的表達(dá)水平，提示IC患者膀胱纖維化過程中RhoA/Rho激酶途徑被活化。推測(cè)IC患者膀胱纖維化至少部分是通過RhoA/Rho激酶信號(hào)通路介導(dǎo)的。

當(dāng)然RhoA/Rho激酶信號(hào)通路可能不是IC患者膀胱纖維化過程中唯一參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在心肌纖維化的研究中，有學(xué)者指出酪氨酸激酶途徑、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）均可能參與引起心肌纖維化［15］。IC患者膀胱纖維化是一個(gè)復(fù)雜的過程，還有那些信號(hào)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子參與其中，有待進(jìn)一步研究。