周文斯，熊犍，謝瑾，崔春，王煒

（華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640）

水蘇糖（Stachyose）是棉籽糖家族的一員。由半乳糖－半乳糖－葡萄糖－果糖構(gòu)成的四糖，是一種非還原糖，廣泛分布于植物界，在植物的各個(gè)部分存在，與蔗糖同為糖類的運(yùn)轉(zhuǎn)和儲(chǔ)存形式。在植物的冷適應(yīng)中起重要作用，對(duì)于人類是一種功能性低聚糖，具有抑制腸道有害菌群增殖、改善排便功能、防止便秘、保護(hù)肝臟、降血壓和血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能［1－3］，其潛在的應(yīng)用價(jià)值及巨大的經(jīng)濟(jì)效益不容忽視。在草石蠶的肉質(zhì)塊莖中含有水蘇糖［4］。

提取高純度的水蘇糖是其應(yīng)用的基礎(chǔ)，是研究的熱點(diǎn)。目前，主要為物理法：水提法和醇沉法［5，6］。得到的水蘇糖提取物中含有蔗糖、葡萄糖等非功能糖，其含量占總糖的30%左右；這些非功能糖不易分離。生物法如曲霉、乳酸菌和裂褶菌輔助提取，生物法與物理方法相比可以得到純度更高的水蘇糖［7－9］。

黑曲霉（Aspergillusniger），是重要的工業(yè)發(fā)酵菌種［10］。食品工業(yè)上用作發(fā)酵菌種，如用于食醋生產(chǎn)制曲、麩曲法白酒生產(chǎn)制曲、檸檬酸發(fā)酵等。本研究根據(jù)微生物優(yōu)先利用單雙糖的特性［11，12］，利用黑曲霉對(duì)草石蠶提取物進(jìn)行發(fā)酵；較大限度地除去單雙糖，保留水蘇糖，提高水蘇糖的純度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草石蠶根莖：購于甘肅鎮(zhèn)原縣，洗凈曬干含水量8.0%；黑曲霉：購自濟(jì)寧玉園生物科技有限公司。

水蘇糖、棉籽糖（濃度98.0%）：Sigma公司；乙腈（色 譜 純）：RCI Labscan Limited 公 司；超 純 水：Millipore制備；D001大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂、D301大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂：安徽皖樹化工銷售有限公司；所有溶劑和樣品溶液均用0.45μm微孔濾膜過濾；葡糖糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、鹽酸、氫氧化鈉、活性炭（粉）：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E型萬分之一電子天平 Mettler Toledo公司；百分之一電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；DHG－9070A型鼓風(fēng)干燥箱 上海慧泰儀器制造有限公司；XW－80A型旋渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠；GL－21M型高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；THZ－82A型水浴恒溫振蕩器 金壇市華城開元實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE－201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；LGJ－1型冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；Waters 600高效液相色譜儀、示差折光檢測(cè)器 美國 Waters公司；Waters ZORBAX NH2色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；Milli－Q 超純水制備器 美國Millipore公司。

1.3 方法

空白樣的制備：參考葉春華等［13］的方法并稍作修改。具體為：稱取洗凈干燥的草石蠶，用水提取其中的水溶性多糖，料液比（g/mL）為1∶15；提取溫度為75℃，提取時(shí)間為75min。

1.3.1 帶渣發(fā)酵對(duì)水蘇糖濃度的影響

按以上方法進(jìn)行得到空白樣后，A1為過濾去除草石蠶殘?jiān)奶崛V液；A2為不進(jìn)行過濾處理，接種量為提取液重量0.02%的黑曲霉，30.0℃恒溫靜置培養(yǎng)48.0h，過濾得到發(fā)酵液A1和A2。

1.3.2 蔗糖酶抑制劑對(duì)水蘇糖濃度的影響

按照1.3.1實(shí)驗(yàn)中不進(jìn)行過濾處理，接種量為提取液重量0.02%的黑曲霉，向提取物B1中添加提取液重量0.01%的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－2Na）；向提取物B2中添加提取液重量0.01%的抗壞血酸（Vc），向提取物B3中添加等質(zhì)量的水作為空白對(duì)照，30.0℃恒溫靜置培養(yǎng)48.0h，過濾得到發(fā)酵液B1，B2和B3。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)方式對(duì)水蘇糖濃度的影響

按照1.3.1實(shí)驗(yàn)中不進(jìn)行過濾處理，接種量為提取液重量0.02%的黑曲霉，添加提取液重量0.01%的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－2Na），提取物C1于30.0℃恒溫靜置培養(yǎng)48.0h，提取物C2于30.0℃恒溫培養(yǎng)48.0，12.0h前為靜置培養(yǎng)，12.0h后為液體震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140r/min，過濾得到發(fā)酵液C1和C2。

1.3.4 水蘇糖濃度的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

分別準(zhǔn)確稱取葡糖糖、果糖、木糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品5.0，15.0，25.0，50.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至 5.0mL，配成 1.0～10.0mg/mL的系列單標(biāo)儲(chǔ)備液；分別準(zhǔn)確稱取蔗糖、棉籽糖5.0，25.0，50.0，75.0，100.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至 5.0mL，配成 1.0～20.0mg/mL的系列單標(biāo)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱取水蘇糖25.0，100.0，250.0，400.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，配成5.0～80.0mg/mL的系列單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于冰箱0～4.0℃下保存。

1.3.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取上述1.3.4.1各糖類標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，配成10.0mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液，置于冰箱0～4.0℃下保存。

1.3.4.3 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取冷凍干燥的水蘇糖0.50g，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，經(jīng)0.45μm 濾膜過濾，濾液供分析用。

1.3.4.4 色譜條件的選擇

高效液相色譜法是檢測(cè)低聚糖的主要方法之一［14］。參照王玉軍等［15］和潘城等［16］的方法并稍作修改。采用示差折光檢測(cè)器，選用色譜柱ZORBAX NH2柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈－水（70/30，V/V），柱溫為35.0℃，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣體積為10.0μL。

1.3.4.5 水蘇糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以水蘇糖濃度為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，由高效液相色譜直接得到水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y＝159063x＋9538.6，R2＝0.9997，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve of stachyose

1.3.4.6 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

采用上述分析條件，所得到的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖分離度均能達(dá)到要求，檢出的樣品色譜峰分離度好、峰形尖、對(duì)稱性好。標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為：木糖（5.769min）、果糖（6.517min）、葡萄糖（7.077min）、半乳糖（7.483min）、蔗糖（8.153min）、麥芽糖（9.422min）、乳糖（10.289min）、棉籽糖（12.281min）、水蘇糖（19.132min），標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2Chromatogram of the standard sample

1.4 數(shù)據(jù)處理

用 OriginPro（Version 9.0）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和圖表的繪制，數(shù)據(jù)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 草石蠶提取液的成分分析

表1 草石蠶提取物的糖類組成Table 1Composition of saccharide in Stachys seiboibi extract%

本實(shí)驗(yàn)利用的水提工藝，每100.00g草石蠶干可以熱提取出27.00g可溶性固形物，得率為27.00%。由表1可知，草石蠶提取物中的主要糖分為：水蘇糖52.69%，蔗糖 17.99%，棉籽糖 13.07%，葡萄糖8.18%及其他糖類8.07%。

2.2 帶渣對(duì)草石蠶提取物的影響

本文考察了空白樣是否分離除渣對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵糖分變化圖Fig.3Changes of carbohydrates during fermentation

由圖3可知，無論是否帶渣，水蘇糖的含量隨時(shí)間的增加而下降，在發(fā)酵12.0h時(shí)水蘇糖的含量最高；帶渣發(fā)酵的發(fā)酵液A2中水蘇糖的含量為14.06mg/mL，不帶渣的發(fā)酵液A1中水蘇糖的含量為4.29mg/mL。這是因?yàn)樵诳瞻讟悠诽崛r(shí)，渣中還有殘余的水蘇糖沒有溶出，故在除去渣后，水蘇糖的含量增加不大，并開始降低；與文獻(xiàn)［17，18］報(bào)道的帶渣發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)相符。在帶渣的黑曲霉發(fā)酵體系中，糖類是黑曲霉的較好碳源，尤其是單糖（葡萄糖、果糖）和雙糖（蔗糖、麥芽糖、乳糖）等優(yōu)先被利用，能夠有效地保留四糖水蘇糖并進(jìn)一步提高其純度。然而，在發(fā)酵體系中超過12.0h后，水蘇糖的濃度開始下降。這是因?yàn)楹谇狗置诔稣崽敲?，蔗糖酶?0～45℃酸性介質(zhì)中具有較好的熱穩(wěn)定性［19］，水解蔗糖的同時(shí)［20］，也將水蘇糖水解為甘露三糖和果糖。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇帶渣發(fā)酵對(duì)草石蠶中的水蘇糖進(jìn)行純化。

2.3 蔗糖酶抑制劑對(duì)草石蠶提取物的影響

本文考察了乙二胺四乙酸二鈉和抗壞血酸作為蔗糖酶抑制劑對(duì)草石蠶提取物的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵糖分變化圖Fig.4Changes of carbohydrates during fermentation

蔗糖酶（EC 3.2.1.26，Sucrase），又稱轉(zhuǎn)化酶（invertase）或β－D－呋喃果糖苷酶（β－D－fructofuranosidase），能夠不可逆地催化蔗糖水解并產(chǎn)生葡萄糖和果糖［21］；還可以催化棉籽糖水解生成蜜二糖和果糖，水蘇糖水解生成甘露三糖和果糖，見圖5。

圖5 蔗糖酶催化蔗糖、棉籽糖和水蘇糖水解圖Fig.5The sucrase catalyzed hydrolysis of sucrose，raffinose and stachyose

部分化學(xué)試劑的存在會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生一定的影響。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了EDTA－2Na和Vc兩種化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響。由圖4（a，b，c）可知，EDTA－2Na和Vc均能夠有效地阻止水蘇糖的降解，而且體系中的棉籽糖濃度下降，兩體系均大于空白的水體系。而添加了EDTA－2Na的發(fā)酵液B1中水蘇糖含量在0～24.0h不斷增加，在24.0h時(shí)水蘇糖的含量達(dá)到最大值。

在黑曲霉發(fā)酵體系中，反應(yīng)前期（＜12.0h），以水蘇糖從渣中溶出為主；反應(yīng)后期（＞12.0h），渣中的水蘇糖含量逐漸下降，溶液中的含量上升，蔗糖酶催化糖類水解的化學(xué)反應(yīng)與黑曲霉吸收利用單雙糖的生化反應(yīng)競爭共存。因此，添加適量的蔗糖酶抑制劑可以抑制蔗糖酶的活性，降低水蘇糖的水解，提高對(duì)水蘇糖的保留，從而達(dá)到純化水蘇糖的效果。

乙二 胺 四 乙 酸 二 鈉 （INS 386）和 抗 壞 血 酸（INS 300）均是常見的國際允許用于食品生產(chǎn)的食品添加劑。EDTA對(duì)蔗糖酶天然酶和修飾酶均有抑制作用［22］；EDTA對(duì)蔗糖酶的抑制作用大于抗壞血酸［23］。因此，在 酸 性 發(fā) 酵 體 系 中，本 實(shí) 驗(yàn) 選 擇EDTA－2Na作為蔗糖酶抑制劑與黑曲霉混合發(fā)酵對(duì)草石蠶中的水蘇糖進(jìn)行純化。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)方式對(duì)草石蠶提取物的影響

本文考察了靜置培養(yǎng)和靜置－液體震蕩兩階段培養(yǎng)方式對(duì)草石蠶提取物的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵糖分變化圖Fig.6Changes of carbohydrates during fermentation

由圖6（a，b）可知，與靜置培養(yǎng)C1相比，靜置－液體震蕩兩階段培養(yǎng)C2條件下，黑曲霉菌絲體生長較好，水蘇糖含量增加，而葡萄糖和蔗糖等單雙糖含量下降，水蘇糖純化效果較好。

黑曲霉是好氧性菌類，靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)都不利于黑曲霉的生長。震蕩培養(yǎng)可以讓黑曲霉接觸更多的氧氣，有利于形成良好的發(fā)酵空間。丁蘭平等探究不同培養(yǎng)方式壇紫菜自由絲狀體生長及藻膽蛋白含量的影響，壇紫菜自由絲狀體在搖床培養(yǎng)條件下生長較好，特定生長速率可達(dá)10.83%～10.89%［24］。駱軍鑫等采用液體震蕩－靜置兩階段培養(yǎng)法進(jìn)行靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，與液體震蕩培養(yǎng)法相比，靈芝菌絲體胞內(nèi)總?cè)坪刻岣吡?.7倍左右，總?cè)飘a(chǎn)量提高了2.5倍左右［25］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇采用靜置－液體震蕩兩階段培養(yǎng)法對(duì)草石蠶中的水蘇糖進(jìn)行純化。

綜上所述，本文在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到黑曲霉發(fā)酵法提純草石蠶中水蘇糖的優(yōu)化工藝為：準(zhǔn)確稱取100.0g草石蠶干，提取溫度為75.0℃，時(shí)間為75.0min，料液比為1∶15提取后；接種提取液重量0.02%的黑曲霉，添加提取液重量0.01%的蔗糖酶抑制劑EDTA－2Na，采用靜置－液體震蕩兩階段培養(yǎng)方式進(jìn)行發(fā)酵提取，發(fā)酵溫度為30.0℃，時(shí)間為24.0h。

2.5 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證

通過20次平行實(shí)驗(yàn)，黑曲霉發(fā)酵法提純草石蠶中水蘇糖的穩(wěn)定性較高。發(fā)酵液通過高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，見圖7。

圖7 黑曲霉發(fā)酵液的高效液相色譜圖Fig.7HPLC of the broth of Aspergillus niger

20次實(shí)驗(yàn)中草石蠶發(fā)酵液中單糖和蔗糖最終總量均小于總糖的3.00%，水蘇糖濃度可以從52.69%提高到80.43%，重復(fù)性良好。使用OriginPro（Version 9.0）軟件對(duì)水蘇糖含量和單雙糖含量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r＝－0.746＊＊（表示相關(guān)性極顯著，P＜0.01）說明二者存在很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，即相同發(fā)酵條件下，單雙糖含量越低，水蘇糖含量越高。

每100.0g草石蠶干，按照上述工藝提取后，活性炭脫色，離子交換樹脂進(jìn)一步脫色和脫鹽，真空濃縮，冷凍干燥，制備得到產(chǎn)物32.06g水蘇糖（含量80.43%）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)條件下，接種黑曲霉，添加蔗糖酶抑制劑EDTA－2Na，采用靜置－液體震蕩兩階段培養(yǎng)方式進(jìn)行發(fā)酵提取，發(fā)酵溫度為30.0℃，時(shí)間為24.0h，可使糖液中單糖和蔗糖含量降至3.00%左右；水蘇糖濃度可從52.69%提高到80.43%。