張　波　廖春華　趙方媛　王子龍　吳小波

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌 330045)

蜜蜂是與人類以及自然界關(guān)系密切的社會(huì)性昆蟲，它不僅可以為人類提供營(yíng)養(yǎng)豐富的蜂產(chǎn)品，而且通過授粉來增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，并維護(hù)生態(tài)平衡，對(duì)保護(hù)和維持生物多樣性起到重要作用[1]。蜂王是蜂群中唯一具有繁殖特性的雌性個(gè)體，蜂王的質(zhì)量對(duì)于蜂群起著決定性作用，高質(zhì)量的蜂王具有更強(qiáng)的產(chǎn)卵能力以及抵抗疾病的能力，因此培育高質(zhì)量的蜂王對(duì)于生產(chǎn)尤為重要[2]。蜂王在幼蟲期和產(chǎn)卵期的食物都是蜂王漿，其營(yíng)養(yǎng)成分主要包括蛋白質(zhì)、游離氨基酸、脂肪酸、糖、維生素等[3]。維生素是昆蟲生長(zhǎng)和代謝所必需的微量有機(jī)物質(zhì)，是輔酶的主要組成成分，維生素缺乏不僅會(huì)影響細(xì)胞代謝，使昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育受阻，而且會(huì)引起組織和細(xì)胞發(fā)生病變。維生素參與蜜蜂機(jī)體內(nèi)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)和新陳代謝，與蜜蜂的健康、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖密切相關(guān)。昆蟲一般自身不能合成維生素，必須從食物中獲取[4]。葉酸作為維持生物體正常生命活動(dòng)所必需的一類有機(jī)物質(zhì)，通常被機(jī)體吸收后最終以至少5種有活性的輔酶形式來參與到機(jī)體內(nèi)一碳單位的轉(zhuǎn)移，對(duì)嘌呤、嘧啶、核酸和蛋白質(zhì)的生物合成以及細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)具有特別重要的作用[5]。蜂王漿中葉酸的含量在0.16～0.50 μg/g，昆蟲在發(fā)育過程中雖然對(duì)葉酸需要量很少，但如果缺少葉酸會(huì)對(duì)高齡幼蟲和蛹的發(fā)育造成影響[6]，而葉酸對(duì)于蜂王質(zhì)量的影響還鮮有報(bào)道。蜂王質(zhì)量包括蜂王初生重、胸長(zhǎng)、胸寬、產(chǎn)卵能力以及相關(guān)基因表達(dá)等，其中，卵黃蛋白原(vitellogenin，Vg)基因是一種多效性基因，與蜜蜂卵巢活性、壽命、免疫力等均具有一定相關(guān)性[7]。儲(chǔ)存蛋白110(hexamerin 110，hex110)和儲(chǔ)存蛋白70b(hexamerin 70b，hex70b)是蜜蜂體內(nèi)重要的儲(chǔ)存蛋白，擔(dān)負(fù)著變態(tài)發(fā)育、級(jí)型分化、性別決定、產(chǎn)卵、壽命、免疫等生物學(xué)功能[8-14]。鑒于此，為了揭示葉酸對(duì)蜂王質(zhì)量的影響，本試驗(yàn)以西方蜜蜂(Apismellifera)為研究對(duì)象，探索額外添加葉酸對(duì)所培育蜂王初生重、胸寬以及卵巢中Vg、hex110和hex70b基因表達(dá)的影響，為培育更高質(zhì)量的蜂王提供參考。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的西方蜜蜂，試驗(yàn)開展時(shí)間為2017年5月至2017年7月。

1.2　主要試劑及器材

葉酸(純度≥98%)和焦炭酸二乙酯(DEPC)水(北京索萊寶科技有限公司)，氯化鈉(分析純，北京西隴化工有限公司)，Trizol總RNA提取試劑盒和RNA酶抑制劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(200 U/μL)、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)和熒光染料(TaKaRa公司)，Oligo(dT)(由美國(guó)英杰生命技術(shù)公司合成)，定量PCR儀(iQTM2，美國(guó)Bio-Rad公司)，核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)Implen公司)，生化培養(yǎng)箱(GZ-250-GSI，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備發(fā)展公司)。

1.3　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1育王及藥物處理

選取一群蜜蜂為蟲源群，控制蜂王產(chǎn)卵8 h。3 d后，按照標(biāo)準(zhǔn)人工育王方法分別在群勢(shì)基本一致的4群西方蜜蜂蜂群中培育西方蜜蜂蜂王，每群1框，每框2排，每排20個(gè)王臺(tái)。從移入幼蟲的第2天起，按照每框的不同區(qū)域，隨機(jī)用微量進(jìn)樣器分別給王臺(tái)內(nèi)的小幼蟲飼喂2 μL含有0、0.05、0.25、1.00 mg/kg葉酸的糖水，并分別標(biāo)記為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組，連續(xù)飼喂3 d。

1.3.2蜂王外部指標(biāo)測(cè)定

蜂王羽化出房后，利用電子天平稱其初生重；剪下蜂王胸部，去掉翅足后，利用形態(tài)觀察系統(tǒng)測(cè)量蜜蜂的胸寬。

1.3.3熒光定量PCR測(cè)定卵巢中Vg、hex110及hex70b基因的相對(duì)表達(dá)量

1.3.3.1樣品采集

剛出房的蜂王測(cè)完初生重、胸寬后立即解剖，采集卵巢，裝入1.5 mL RNase-free的EP管并迅速放入液氮中，用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.3.2總RNA的提取以及cDNA的合成

參考秦秋紅[15]的試驗(yàn)方法對(duì)樣本總RNA進(jìn)行提取，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)提取的總RNA的純度(OD260/280在1.9～2.1，符合標(biāo)準(zhǔn))，瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA的28S、18S和5S這3個(gè)條帶的完整性。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3.3熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)及熒光定量PCR

1.4　數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件中的ANOVA程序進(jìn)行差異顯著性比較分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　葉酸對(duì)西方蜜蜂蜂王初生重及胸寬的影響

由表2可知，Ⅱ組蜂王的初生重顯著高于Ⅰ組、Ⅲ組及Ⅳ組(P<0.05)，而Ⅱ組、Ⅲ組及Ⅳ組之間差異不顯著(P>0.05)；蜂王的胸寬4個(gè)組的結(jié)果比較接近，差異均不顯著(P>0.05)。

2.2　葉酸對(duì)西方蜜蜂蜂王卵巢中Vg基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1可知，Ⅰ組、Ⅲ組蜂王卵巢中Vg基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅳ組(P<0.05)，但Ⅰ組、Ⅱ組及Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)，Ⅱ組與Ⅳ組之間差異也不顯著(P>0.05)。

表1　基因引物序列

表2　葉酸對(duì)西方蜜蜂蜂王初生重和胸寬的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in the same column with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Date columns with the same letters mean no significant difference (P>0.05), while with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1葉酸對(duì)蜂王卵巢中Vg基因相對(duì)表達(dá)量的影響

Fig.1Effects of folic acid on the relative expression level ofVggene in ovary of queens for Western honeybee (Apismellifera)

2.3　葉酸對(duì)西方蜜蜂蜂王卵巢中hex110基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖2可知，隨著葉酸濃度的增加，卵巢中hex110基因的相對(duì)表達(dá)量先增加后降低，其中Ⅱ組顯著高于Ⅰ組、Ⅲ組和Ⅳ組(P<0.05)，Ⅲ組顯著高于Ⅰ組和Ⅳ組(P<0.05)，Ⅰ組顯著高于Ⅳ組(P<0.05)。

圖2　葉酸對(duì)蜂王卵巢中hex110基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4　葉酸對(duì)西方蜜蜂蜂王卵巢中hex70b基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖3可知，Ⅰ組、Ⅱ組及Ⅲ組蜂王卵巢中hex70b基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅳ組(P<0.05)，但Ⅰ組、Ⅱ組及Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖3　葉酸對(duì)西方蜜蜂蜂王卵巢中hex70b相對(duì)表達(dá)量的影響

3　討　論

營(yíng)養(yǎng)是影響蜜蜂健康的重要因素，合理、均衡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)以及適宜的環(huán)境條件是蜜蜂健康生長(zhǎng)的重要條件。蜜蜂的營(yíng)養(yǎng)需要主要包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂類及維生素需要等[18]。雖然維生素的需要量相對(duì)較少，但維生素對(duì)蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。蜂王的質(zhì)量決定蜂群群勢(shì)的強(qiáng)弱，蜂王的初生重與蜂王的質(zhì)量成正比關(guān)系，初生重大的蜂王，具有發(fā)育良好的卵巢和數(shù)量較多的卵巢管，這種蜂王具有較強(qiáng)的產(chǎn)卵力[19]。本研究發(fā)現(xiàn)：額外添加低濃度的葉酸可增加蜂王的初生重，額外添加高濃度的葉酸對(duì)蜂王的初生重沒有顯著影響，可能由于葉酸作為維持生物體正常生命活動(dòng)所必需的一類有機(jī)化合物，被機(jī)體吸收后轉(zhuǎn)變成輔酶，參與機(jī)體內(nèi)一碳單位的轉(zhuǎn)移，對(duì)嘧啶、嘌呤、核酸和蛋白質(zhì)的生物合成以及細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)具有特別重要的作用，促進(jìn)了基因表達(dá)及細(xì)胞的分裂增長(zhǎng)[5]，從而提高了蜂王的初生重；過量的葉酸可能未被蜂王幼蟲所吸收，同時(shí)還可能影響了蜜蜂其他代謝過程，從而影響其他機(jī)能，如蜂王卵巢相關(guān)基因的表達(dá)等。

Vg是一類大分子量的糖脂復(fù)合蛋白質(zhì)，廣泛存在于卵生脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物的血淋巴脂肪體和卵等器官中，是蜜蜂卵黃發(fā)生的關(guān)鍵物質(zhì)，具有激活卵巢、生殖競(jìng)爭(zhēng)、行為構(gòu)建、延長(zhǎng)壽命、轉(zhuǎn)化食物等多種功能，Vg是卵黃蛋白的前體，卵黃蛋白為胚胎發(fā)育提供蛋白質(zhì)、必需氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，卵巢發(fā)育好的蜂王，具有較高的Vg基因表達(dá)量，因此Vg基因的表達(dá)量也是衡量蜂王質(zhì)量的重要指標(biāo)[20-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葉酸組(Ⅳ組)蜂王卵巢中Vg基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(Ⅰ組)，而低濃度葉酸組(Ⅱ組)和中濃度葉酸組(Ⅲ組)與對(duì)照組差異不顯著，這也說明過量的葉酸會(huì)抑制蜂王卵巢中Vg基因表達(dá)，從而影響蜂王的發(fā)育。

儲(chǔ)存蛋白是昆蟲儲(chǔ)存起來供以后作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使用的蛋白質(zhì)。儲(chǔ)存蛋白一般是由6個(gè)亞基構(gòu)成的六聚體蛋白，是由幼蟲脂肪體細(xì)胞合成并分泌釋放到血淋巴內(nèi)，蜜蜂體內(nèi)有4種儲(chǔ)存蛋白基因，按照其分子質(zhì)量大小分別命名為hex110、儲(chǔ)存蛋白70a(hexamerin 70a，hex70a)、hex70b和儲(chǔ)存蛋白70c(hexamerin 70c，hex70c)[13]。研究發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存蛋白在許多昆蟲中與雌性昆蟲產(chǎn)卵有關(guān)，而且儲(chǔ)存蛋白的表達(dá)與其產(chǎn)卵能力密切相關(guān)[29-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著葉酸濃度的增加，蜂王卵巢中hex110基因的相對(duì)表達(dá)量先增加后降低，以Ⅱ組最高。這說明，在育王時(shí)額外添加低濃度的葉酸可促進(jìn)卵巢中hex110基因的表達(dá)，過高濃度的葉酸會(huì)抑制hex110基因的表達(dá)。hex110是蜂王卵巢中重要的基因[33]，在產(chǎn)卵蜂王卵巢中高表達(dá)，hex110的高表達(dá)有利于蜂王卵巢的發(fā)育，提高蜂王的繁殖性能[13]，hex110基因表達(dá)量相對(duì)較低，則不利于蜂王卵巢的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葉酸組蜂王卵巢中hex70b基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組、低濃度葉酸組和中濃度葉酸組，但低濃度葉酸組和中濃度葉酸組與對(duì)照組之間差異不顯著，這說明過量的葉酸也抑制了蜂王卵巢中hex70b基因的表達(dá)。hex70b是富含蛋氨酸和亮氨酸的儲(chǔ)存蛋白，不僅與蜜蜂級(jí)型分化有關(guān)，還與蜂王以及雄蜂的性腺發(fā)育有關(guān)[13]，hex70b基因的表達(dá)下降影響著蜂王卵巢發(fā)育質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)，額外添加高濃度(1.00 mg/kg)的葉酸后蜂王卵巢中Vg、hex110和hex70b基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。Pickell等[34]研究發(fā)現(xiàn)，過量的葉酸會(huì)引起DNA的過甲基化，改變其表觀遺傳學(xué)特征，高濃度葉酸攝取會(huì)引起胚胎發(fā)育紊亂從而影響基因表達(dá)。

4　結(jié)　論

在育王時(shí)額外添加葉酸對(duì)西方蜜蜂蜂王質(zhì)量存在影響，額外添加1.00 mg/kg的葉酸導(dǎo)致蜂王卵巢中Vg、hex110和hex70b基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降；額外添加0.25 mg/kg的葉酸顯著提高了蜂王卵巢中hex110基因的相對(duì)表達(dá)量；額外添加0.05 mg/kg的葉酸顯著提高了蜂王的初生重、卵巢中hex110基因的相對(duì)表達(dá)量。由此可知，育王時(shí)可添加0.05 mg/kg的葉酸來提高蜂王質(zhì)量。