李 希，王 曦，吳蘇君

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032）

呂梁黑山羊是山西省特有的地方優(yōu)良品種，也是我國(guó)珍貴的畜種資源，主要分布在呂梁山區(qū)一帶，由于其抗寒、抗病、適應(yīng)性強(qiáng)、易抓膘、肉質(zhì)鮮嫩等特點(diǎn)，深受人們的喜愛(ài)。但由于多年來(lái)市場(chǎng)導(dǎo)向的變化及對(duì)地方品種重視不夠，使得其品種資源受到嚴(yán)重威脅[1]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，純種黑山羊數(shù)量正在急速銳減，而且已處于瀕?；驕缃^的邊緣[2]，急需保護(hù)。傳統(tǒng)的活畜保種方法成本高，受群體和個(gè)體生理利用年限制約，而體細(xì)胞保種占地小，且沒(méi)有品種以及個(gè)體數(shù)量的限制，在長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源研究中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前，尚未見(jiàn)到在細(xì)胞水平上對(duì)呂梁黑山羊進(jìn)行研究保護(hù)的相關(guān)報(bào)道。成纖維細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，取材方便且易于培養(yǎng)，并具有高度遺傳穩(wěn)定性[3-6]。

本研究旨在通過(guò)保存呂梁黑山羊的耳成纖維細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)呂梁黑山羊這一物種的遺傳資源在細(xì)胞水平上的長(zhǎng)期保存，以3月齡呂梁黑山羊耳組織為研究對(duì)象，利用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)呂梁黑山羊耳緣成纖維細(xì)胞，并嘗試對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染條件摸索，以期為后續(xù)呂梁黑山羊遺傳資源保護(hù)與利用提供依據(jù)，及為開(kāi)展相關(guān)生物技術(shù)研究如轉(zhuǎn)基因克隆羊的制備提供試驗(yàn)材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

呂梁黑山羊（雄性3只，雌性3只）的耳緣組織采自嵐縣耀康農(nóng)牧科技有限公司實(shí)驗(yàn)羊場(chǎng)。

DMEM購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清FBS購(gòu)自Hyclone 公司；胰蛋白酶，NaHCO3，HEPES，DPBS，二甲基亞砜（DMSO），兩性霉素 B，Hoechst 33342，0.4%Trypan blue，pEGFP-N1質(zhì)粒購(gòu)自Sigma公司，雙抗為國(guó)產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)皿及24孔板購(gòu)自Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耳緣皮膚組織的采集及分離培養(yǎng) 先刮凈黑山羊耳毛，拿采樣鉗剪取靠近耳尖約1 cm2大小的皮膚組織塊，放入加有雙抗的DMEM中，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)中將組織塊徹底除凈毛發(fā)，用消過(guò)毒的眼科剪除掉結(jié)締組織并剪成1 mm2的小塊，均勻接種到60 mm培養(yǎng)皿底部，倒置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中6～8 h，待組織塊貼緊皿底后，加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM＋15%FBS＋1%雙抗＋2.5 μg/mL兩性霉素 B）4 mL，培養(yǎng)5～7 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，進(jìn)行下一步傳代或冷凍保存。

1.2.2 細(xì)胞傳代及成纖維細(xì)胞的純化 當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，棄掉原液，加入預(yù)熱的0.25%的胰蛋白酶 1 mL，37℃作用 3～5 min，待80%的細(xì)胞變圓時(shí)，立即加入含有血清的DMEM培養(yǎng)液2 mL，并用槍頭輕輕吹打皿底，之后收集細(xì)胞于15 mL的離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，重懸后接種至新的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，再次傳代。細(xì)胞的純化依據(jù)成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的敏感性高，脫壁快，而上皮細(xì)胞則敏感性差、脫壁慢。這樣經(jīng)過(guò)數(shù)次傳代分離后只剩下純的成纖維細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇 常規(guī)方法消化細(xì)胞，離心去上清后加入4℃預(yù)冷的凍存液（DMEM＋15%FBS＋10%DMSO），輕輕吹打混勻后，將懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌凍存管中，封口后裝入異丙醇冷凍盒中，冰箱-70℃過(guò)夜冷凍，第2天轉(zhuǎn)入液氮保存。將細(xì)胞從液氮中取出后馬上投入37℃水浴中，融解后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，并用10倍新鮮培養(yǎng)液稀釋，1 500 r/min離心5 min，去除冷凍液中DMSO毒性，棄上清后用新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞復(fù)蘇后的活力測(cè)定 取復(fù)蘇后的細(xì)胞懸液90 μL加10 μLTrypan blue，混勻后血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞活率。

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞以每孔1.0×104個(gè)接種到24孔板中培養(yǎng)，從接種開(kāi)始，每24 h計(jì)數(shù)一次細(xì)胞密度，連續(xù)8 d計(jì)數(shù)，根據(jù)時(shí)間和細(xì)胞密度繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 細(xì)胞污染的檢測(cè) 細(xì)菌的檢測(cè)：將細(xì)胞用不添加抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)3～4 d，觀察培養(yǎng)液有無(wú)變渾濁或者變黃；真菌的檢測(cè)：同樣的方法培養(yǎng)細(xì)胞3～4 d，觀察培養(yǎng)液有無(wú)出現(xiàn)云霧狀或者纖維狀菌絲體；病毒的檢測(cè)：同樣的方法觀察有無(wú)出現(xiàn)蝕斑、空斑等現(xiàn)象；支原體檢測(cè)：細(xì)胞用不添加抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)3～4 d后，用固定液固定細(xì)胞10 min，室溫下 Hoechst 33342染色 30 min，DPBS洗3次，然后于紫外光下觀察，判斷有無(wú)支原體污染。

1.2.7 轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞，PBS離心洗滌2次，細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL。加入pEGFP-N1質(zhì)粒10 μg，使每個(gè)樣品總體積為0.4mL?；旌暇鶆蚝筠D(zhuǎn)到4 mm電轉(zhuǎn)杯中，4℃靜置10min。然后分別以不同的電壓（200，220，240，260 V），不同脈沖時(shí)間（10，15，20，25 ms），1 次脈沖進(jìn)行電擊。電擊結(jié)束后，輕輕混勻細(xì)胞并迅速接種到35mm培養(yǎng)皿中。48 h后，根據(jù)綠色熒光蛋白表達(dá)情況來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 呂梁黑山羊原代成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)6～7 d可觀察到組織塊邊緣有極少量梭形、不規(guī)則三棱形的成纖維細(xì)胞爬出，同時(shí)還有上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)，沒(méi)有組織塊的區(qū)域則細(xì)胞密度極低，幾乎沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)（圖1-A）。培養(yǎng)至第12天時(shí)可明顯看到有細(xì)胞沿組織塊周邊向外擴(kuò)散，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均有，二者間界限明顯（圖1-B），且成纖維細(xì)胞間間隙大，上皮細(xì)胞之間沒(méi)有間隙。

2.2 傳代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，主要呈梭形、長(zhǎng)條形、多角形或不規(guī)則形，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿匯合后呈漩渦狀走形。成纖維細(xì)胞的純化可根據(jù)其與上皮細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感程度和傳代后貼壁時(shí)間的不同，一般經(jīng)過(guò)3～4次傳代，細(xì)胞僅剩成纖維細(xì)胞。胰酶消化脫壁后的細(xì)胞形態(tài)如圖2-A所示，傳代后的細(xì)胞形態(tài)如圖2-B所示。

2.3 細(xì)胞活力和貼壁率分析

本研究將傳代后的第4～6代呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞冷凍起來(lái)作為長(zhǎng)期保存，共凍存細(xì)胞312管。隨后將凍存180，360 d的第5代細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇后平均活率分別為87.9%，83.2%，復(fù)蘇的細(xì)胞在12 h左右就已經(jīng)大量貼壁并呈梭形生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h后，消化統(tǒng)計(jì)貼壁率分別為78.6%，74%。說(shuō)明液氮長(zhǎng)期凍存對(duì)細(xì)胞活力有一定影響，但是復(fù)蘇培養(yǎng)一段時(shí)間后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，凍存不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成永久損傷。

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

連續(xù)8 d記數(shù)細(xì)胞密度并得到細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖3所示。由圖3可知，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線總體呈S型分布，符合標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。剛接種的細(xì)胞由于胰蛋白酶消化損傷而生長(zhǎng)緩慢，此期為細(xì)胞的適應(yīng)階段，從第2天開(kāi)始細(xì)胞加速生長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4～6天為細(xì)胞活性最佳時(shí)期，第6天以后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞逐漸衰老直至死亡，因此，要在細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期之前及時(shí)傳代。

2.5 微生物污染檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 細(xì)菌、真菌及病毒檢測(cè)結(jié)果 顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，未見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁，也無(wú)絲狀物生長(zhǎng)，沒(méi)有觀察到空斑、蝕斑現(xiàn)象，表明不存在細(xì)菌、真菌及病毒污染。

2.5.2 支原體檢測(cè)結(jié)果 熒光顯微鏡下僅細(xì)胞核顯示藍(lán)色熒光，細(xì)胞周圍沒(méi)有發(fā)現(xiàn)熒光小點(diǎn)，無(wú)支原體污染。其結(jié)果如圖4所示。

2.6 電轉(zhuǎn)染條件摸索

本研究以常用的質(zhì)粒載體pEGFP-N1為外源DNA，電轉(zhuǎn)染呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞，對(duì)電轉(zhuǎn)染的電壓和電擊時(shí)間條件分別進(jìn)行探討，通過(guò)計(jì)算轉(zhuǎn)染效率來(lái)摸索適合呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件。在電擊時(shí)間相同情況下，電壓為240 V時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高（圖5）。在電壓一定的情況下，脈沖時(shí)長(zhǎng)為20 ms時(shí)的轉(zhuǎn)染效率較高（圖6）。

3 討論

3.1 關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)

原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法主要有胰蛋白酶消化法和組織塊貼壁法[7]。胰蛋白酶消化法適用于軟組織的分離，對(duì)較硬的纖維組織則消化效果差，且對(duì)細(xì)胞損傷較大[8]。組織塊貼壁法操作簡(jiǎn)單，且不易污染，對(duì)細(xì)胞損傷小，是目前培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的首選方法[9]。耳組織取材容易，又不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成傷害，是目前活細(xì)胞保種常用的材料，但由于耳組織中含有不利于細(xì)胞分散的膠原等成分，使原代細(xì)胞從組織塊中游離出來(lái)所需時(shí)間變長(zhǎng)，一般6～9 d才會(huì)有細(xì)胞爬出[10-13]。本研究原代培養(yǎng)時(shí)，先將組織塊鋪于培養(yǎng)皿皿底，倒置在培養(yǎng)箱中6～8 h，待組織塊貼緊后加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d左右才有極少量細(xì)胞爬出，約20 d才能鋪滿皿底。原代細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢，可能與動(dòng)物年齡和操作環(huán)節(jié)有很大關(guān)系[14]，如組織塊在酒精中浸泡時(shí)間不宜超過(guò)30 s，浸泡時(shí)間稍長(zhǎng)就會(huì)影響細(xì)胞從組織中游離出來(lái)的時(shí)間[15-17]。

3.2 關(guān)于細(xì)胞污染

細(xì)胞污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的問(wèn)題，細(xì)胞一旦遭到污染，所有的試驗(yàn)結(jié)果都會(huì)變得毫無(wú)意義[18-19]。因此，能夠及時(shí)檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞是否污染至關(guān)重要。細(xì)菌污染容易檢測(cè)，通過(guò)肉眼觀察培養(yǎng)基顏色變化即可發(fā)現(xiàn)，受細(xì)菌污染的培養(yǎng)液變渾濁，細(xì)胞很快出現(xiàn)脫壁死亡，只要做好常規(guī)的消毒滅菌就可避免細(xì)菌污染，但無(wú)法徹底清除霉菌孢子，霉菌生長(zhǎng)速度緩慢，一般在培養(yǎng)箱環(huán)境下培養(yǎng)96 h，才能肉眼觀察到絮狀的菌絲[20]，所以，很難及時(shí)發(fā)現(xiàn)。本研究在原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中曾多次受到霉菌侵犯，主要與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境潮濕有關(guān)。原代細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)也增加了污染的概率。為防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染，首先，試驗(yàn)操作必須遵守嚴(yán)格的無(wú)菌操作程序，試驗(yàn)用品須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格洗滌和滅菌程序處理，培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)先用酒精擦拭后再開(kāi)紫外殺菌[21-22]。其次，潮濕的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境一定要注意霉菌清除。本研究采用過(guò)氧乙酸熏蒸加火焰灼燒法來(lái)清除環(huán)境中霉菌。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中添加2.5 μg/mL兩性霉素B能很好的抑制霉菌污染。

3.3 轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染作為檢測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的一個(gè)有效方法，能間接地評(píng)價(jià)建立的細(xì)胞系成功與否。電轉(zhuǎn)染是一種簡(jiǎn)單、重復(fù)性好且高效的轉(zhuǎn)染方法[23]。不同動(dòng)物、不同類型的細(xì)胞所需的電轉(zhuǎn)染條件不同[24]，因此，本研究通過(guò)電轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒到呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞來(lái)篩選出合適呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果顯示，電壓240 V，脈沖時(shí)長(zhǎng)20 ms，1次脈沖的條件下，轉(zhuǎn)染效率較高。本研究只考慮了不同參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，而未考慮電轉(zhuǎn)后細(xì)胞存活率，下一步將結(jié)合電轉(zhuǎn)后細(xì)胞死亡率優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件，為以后轉(zhuǎn)基因克隆的研究提供依據(jù)。