楊金宏，孔衛(wèi)青

（安康學(xué)院，陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康 725000）

白粉病廣泛發(fā)生在黃瓜、小麥、草莓、蘋果、葡萄、甜瓜等多種作物中，患病植株的葉片散生白色細(xì)小霉斑，擴(kuò)大后連成一片，布滿葉背，病斑中央密生黃色小顆粒，逐漸增多，由黃色轉(zhuǎn)橙紅變褐，最后變成黑色，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。黃瓜白粉病是黃瓜栽培中的常見病害之一，ZHANG等[1]（2015）在黃瓜對白粉病抗性基因的研究中發(fā)現(xiàn)，黃瓜Csa5M650450.1參與了該病的防御反應(yīng)，該基因是擬南芥AtPP2-B15的同源基因，這是一類N端為F-box結(jié)構(gòu)，C端為PP2結(jié)構(gòu)的F-box蛋白（F-boxprotein，F(xiàn)BP），廣泛存在于酵母、擬南芥、小麥、蘋果等真核生物中[2-5]。

FBP是泛素連接酶的成分之一，參與植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)噬作用、免疫、DNA修復(fù)以及蛋白降解等[2-3，6-8]。同時，PP2-B15 還與植物生長負(fù)相關(guān)，對 Cd壓力敏感，可以作為Cd壓力生物標(biāo)記的候選[3，9-10]。番茄中PP2-B15是應(yīng)對salinity壓力的調(diào)節(jié)者[11]。MORANLAUTER等[12]利用鐵缺陷型培養(yǎng)基對大豆進(jìn)行處理，對參與大豆根和葉中早期缺鐵黃化病的信號基因進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與擬南芥AtPP2-B15同源基因在處理6 h后的根中表達(dá)上調(diào)。

桑里白粉病又稱白背病，廣泛分布于我國大多數(shù)蠶區(qū)，主要對晚秋桑葉造成危害，使桑葉提前硬化，營養(yǎng)下降，嚴(yán)重時桑葉脫落，家蠶拒食桑葉，影響正秋蠶和晚秋蠶期的養(yǎng)蠶生產(chǎn)。通過桑里白粉病被害葉不同齡期養(yǎng)蠶成績的調(diào)查可知，該病葉片對幼蟲生命力及繭質(zhì)有較大的影響[13]。

根據(jù)已有研究對PP2-B15作用的描述，本研究利用同源克隆技術(shù)，獲得了桑樹中的同源基因MaPP2-B15，并對其在桑樹葉片、葉柄、葉脈以及枝條桑樹韌皮部組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，旨在為進(jìn)一步研究該基因在桑樹中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選取陜西省種植面積較大且對桑里白粉病具有一定抗性的強(qiáng)桑一號，取自安康學(xué)院恒口蠶?？蒲谢兀⌒迈r葉片、葉柄、葉脈、韌皮部組織等提取總RNA。

1.2 MaPP2-B15基因的生物信息學(xué)分析與引物設(shè)計

基因信息從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://morus.swu.edu.cn/morusdb/filebrowser）的桑樹同源基因數(shù)據(jù)庫獲取[14]，以PP2-B15為目標(biāo)對功能列進(jìn)行檢索過濾，獲得一個ID為MOPG06953的桑樹同源基因，及其對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本L484_007289的氨基酸序列。利用該序列對桑樹基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對tblastn檢索，獲得桑樹同源基因序列。primer premier 5.0 軟 件 設(shè) 計 引 物 序 列 為 ：7289F：5′-ATGTTTTTACCAGAAGACTGTG-3′；7289R：5′-TGTTAGTCCTTAG-GCCTCACT-3′，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 桑樹葉片RNA的提取與MaPP2-B15基因的RT-PCR擴(kuò)增

植物RNA提取試劑盒（Tiangen生化科技（北京）有限公司）完成桑樹葉片總RNA的提取，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解提取的總RNA，配制1.2%瓊脂糖凝膠，對總RNA進(jìn)行電泳，檢測RNA的完整性，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（北京全式金生物技術(shù)有限公司）對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到第1鏈cDNA，以此為模板，以7289F和7289R引物和NEB公司Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；最后72℃終延伸8 min。配制1.2%瓊脂糖凝膠，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

1.4 MaPP2-B15基因的克隆測序與序列分析

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，連接pGEM-T載體（Promega）進(jìn)行克隆。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆進(jìn)行雙向測序（生工生物工程（上海）有限公司）。運(yùn)用sim4程序?qū)λ没蛐蛄械慕Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，序列推定蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)通過在線EXPASY（http://www.expasy.org/）網(wǎng)站進(jìn)行分析，NCBI在線BLASTP比對對序列的相似性進(jìn)行分析，在線CDD預(yù)測基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，多重比對分析及分析結(jié)果的著色利用Clustal X 1.83軟件和Boxshade（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）網(wǎng)站進(jìn)行。

1.5 MaPP2-B15基因的表達(dá)

提取桑樹葉片、葉脈、葉柄和枝條桑樹韌皮部組織的RNA，運(yùn)用7289F和7289R引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25，其他同1.3，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，EB染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹MaPP2-B15基因PCR擴(kuò)增和克隆測序

以桑樹葉片為材料，進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄，利用7289F，7289R引物對進(jìn)行桑樹MaPP2-B15基因的PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果在約800 bp處獲得單一條帶（圖1），與預(yù)期大小相符?；厥赵摂U(kuò)增條帶并進(jìn)行克隆測序，獲得基因的序列818 bp（圖 2，GenBank 登錄號：MG546686）。

2.2 桑樹MaPP2-B15基因序列分析

2.2.1 MaPP2-B15基因結(jié)構(gòu)分析 以桑樹基因組框架圖為參照，運(yùn)用sim4程序分析桑樹MaPP2-B15基因位置結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示，基因有3個外顯子，外顯子內(nèi)含子邊界符合gt/ag規(guī)則（圖2）。

2.2.2 桑樹MaPP2-B15蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析MaPP2-B15基因編碼271個氨基酸，其中，正電荷氨基酸殘基（Arg＋Lys）31個，負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp＋Glu）38個，理論等電點(diǎn)（pI）5.49，是一種酸性蛋白質(zhì)。分子式為C1363H2128N364O417S14，分子質(zhì)量為30.735 ku。預(yù)測蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為43.96，是一種不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)和氨基酸殘基總平均疏水系數(shù)（GRAVY）分別為79.11和-0.384，是親水蛋白（圖 3）。

預(yù)測基因編碼的3～44位氨基酸為F-box結(jié)構(gòu)域，94～269位氨基酸為植物韌皮部蛋白結(jié)構(gòu)PP2結(jié)構(gòu)域（圖4），具有凝集素活性或結(jié)合RNA的特征。

在線BLASTP程序比對MaPP2-B15基因編碼的氨基酸序列，與川桑（Morus notabilis）的F-box蛋白（EXB60973）一致性為97%，與核桃（Juglans regia，XP_018858311）、土瓶草（Cephalotus follicularis，GAV67823）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002279245）、木薯（Manihot esculenta，OAY44004）、橙子（Citrus sinensis，KDO70549）、橡膠樹（Hevea brasiliensis，XP_021682309）、榴蓮（Durio zibethinus，XP_022719471）、毛 果 楊 （Populus trichocarpa，ERP60237）、 可 可（Theobroma cacao，EOY11556）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas，KDP38872）、蓖麻（Ricinus communis，EEF 33114）、番木瓜（Carica papaya，XP_021898946）等的F-box蛋白PP2-B15一致性在55%以上，相似性均在70%以上。多重序列比對顯示，MaPP2-B15蛋白的F-box和PP2結(jié)構(gòu)域在各物種間比較保守，F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)的保守氨基酸及其位點(diǎn)符合該結(jié)構(gòu)的典型特征（圖 5）。

2.3 MaPP2-B15基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測

RT-PCR對MaPP2-B15基因在桑樹葉片、葉柄、葉脈和枝條韌皮部組織等中表達(dá)進(jìn)行檢測，電泳檢測結(jié)果顯示，基因在所檢測的各桑樹組織中均有表達(dá)（圖6）。

3 結(jié)論與討論

FBP由位于該類蛋白N端的F-box結(jié)構(gòu)域和位于C端的與蛋白相互作用密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域組成，其中，F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域由大約40～50個氨基酸組成，有幾個氨基酸殘基比較保守，一般為L/MP（6）I/V（3）L/M（11）S/C，其他位置缺少嚴(yán)格的保守序列，一般采用三級結(jié)構(gòu)的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫來鑒定。本研究利用在線CDD預(yù)測桑樹MaPP2-B15基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，獲得其3～44位為F-box結(jié)構(gòu)域。

FBP家族是擬南芥最大的超家族，不僅參與植物生長素、赤霉素、茉莉酸、乙烯等信號途徑，而且還在植物發(fā)育、逆境以及植物受到不同外界環(huán)境、病原刺激和脅迫時的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[2-3，15]。李彥澤[16]在對擬南芥干旱基因相關(guān)基因的研究中，獲得一個受干旱誘導(dǎo)較明顯的F-box基因AtPP2-B11。本研究桑樹MaPP2-B15基因編碼的94～269位氨基酸為PP2結(jié)構(gòu)域，是植物韌皮部蛋白結(jié)構(gòu)，具有凝集素活性或結(jié)合RNA的特征。RT-PCR技術(shù)檢測MaPP2-B15基因在所調(diào)查的桑樹組織器官中表達(dá)量無明顯差異。植物韌皮部蛋白在植物形態(tài)維持、抵御外界物理傷害及抗病方面有較大作用[17-20]。綜合本研究以及前人研究，推測桑樹MaPP2-B15基因可能參與了桑樹的多種生物學(xué)功能，對該基因及其功能的進(jìn)一步研究也將有助于我們對桑樹的生長發(fā)育及逆境生物學(xué)的了解。