鄭婷婷，李 磊，徐 敏，王美琴

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

近年來，隨著人們對(duì)食品安全、環(huán)境污染及生態(tài)平衡等一系列問題的重視，減少化肥和農(nóng)藥的使用，研制和開發(fā)微生物菌肥及生防菌劑已成為植保界和農(nóng)藥界共同關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。微生物菌劑按照有效成分的不同，可分為細(xì)菌類、真菌類和病毒類，其中，細(xì)菌類微生物菌劑主要是以芽孢桿菌為有效成分[2-4]。芽孢桿菌（Bacillus spp.）能夠形成具有耐熱、耐旱、抗紫外線的芽孢且易于繁殖，對(duì)不良環(huán)境具有很強(qiáng)抵抗力，還可以分泌抗生素、抗菌蛋白和多肽類等多種抗菌活性物質(zhì)，不僅可以殺死植物病原物，還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，從而成為生防菌劑的良好材料[5-7]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，在我國(guó)，科研工作者對(duì)具有生防作用的芽孢桿菌進(jìn)行了廣泛研究，如張榮勝等[8]篩選到1株解淀粉芽孢桿菌Lx-11，對(duì)細(xì)菌性條斑病菌的田間防效達(dá)60.2%，顯著高于化學(xué)藥劑20%葉枯唑防效；王奕文等[9]從甜瓜表面分離到1株解淀粉芽孢桿菌，對(duì)灰葡萄孢、鏈格孢和尖孢鐮刀菌等8種果蔬病原真菌具有廣譜的拮抗作用。在美國(guó)，Agraquest公司開發(fā)的活菌殺菌劑 Serenade TM和Sonata AS，可防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等病害。澳大利亞開發(fā)的Bacillus subtilis A-13對(duì)麥類和胡蘿卜立枯病以及其他土傳病害具有很好的防治和增產(chǎn)作用[10]。但是，目前對(duì)芽孢桿菌的研究仍主要集中在室內(nèi)生防菌株的鑒定與篩選、抑菌試驗(yàn)、促生作用、發(fā)酵條件及抑菌機(jī)理等方面，真正運(yùn)用在實(shí)踐當(dāng)中并登記的生防菌劑還很少[11]。

生防菌劑的劑型較多的是可濕性粉劑、懸浮劑及顆粒劑，其中，乳懸劑為懸浮劑中的一種，是以溶劑油為主要成分，添加不同的助劑，如乳化劑、抗生素、防凍劑等，加工制成高效無公害、性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)人和環(huán)境安全的微生物農(nóng)藥制劑[12-13]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病害與生物防治課題組前期篩選鑒定出1株核桃內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（B.amylol-iquefaciens）Ht-q6（專利號(hào)：ZL 201410469787.6），室內(nèi)研究證明，該菌株抑菌譜廣、易在植物體內(nèi)定殖及作用穩(wěn)定，具有開發(fā)研制生防菌劑的潛力[14]。

本試驗(yàn)以Ht-q6菌株為材料，以目前生產(chǎn)上危害嚴(yán)重的番茄早疫病菌為指示菌，通過助劑的篩選，按照國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，研制出生防菌Ht-q6乳懸劑，旨在為生產(chǎn)上開發(fā)應(yīng)用提供資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為生防菌Ht-q6和番茄早疫病菌（Alternaria solani），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

溶劑油為芥末油、花椒油、芝麻油、花生油、胡麻油。乳化劑為吐溫-80和OP-10?？股貫閮尚悦顾亍⒒尹S霉素、制霉菌素。防凍劑為氯化鈣、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇。潤(rùn)濕劑為十二烷基苯磺酸鈉，洗衣粉，D-317，DCM-82。穩(wěn)定劑為 CaCO3，K2HPO4，KH2PO4，CHC-Na。保護(hù)劑為抗壞血酸、羧甲基纖維素、糊精、熒光增白劑。培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生防菌Ht-q6發(fā)酵液的制備 用接種環(huán)挑取生防菌Ht-q6，通過平板劃線培養(yǎng)法，將其接種于NA平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)24 h，然后將活化菌株接種到100 mLNB培養(yǎng)液中，接種量1%，置于搖床上，以30℃，180 r/min速度振蕩培養(yǎng)72 h，芽孢率≥90%。

1.3.2 番茄早疫病菌芽孢懸浮液的制備 取番茄早疫病菌接種在PDA平板上，將其置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用無菌刀把培養(yǎng)物切成5 mm×5 mm的菌塊，接入水瓊脂培養(yǎng)液中，黑暗放置3 d后產(chǎn)生大量分生孢子，用無菌水稀釋振蕩均勻，得到濃度為106cfu/mL的孢子懸浮液[15]。

1.3.3 生防菌Ht-q6乳懸劑助劑篩選

1.3.3.1 溶劑油和乳化劑的篩選[16]溶劑油：取1 mL生防菌Ht-q6發(fā)酵液分別加入到10 mL不同的溶劑油中，置于小錐形瓶?jī)?nèi)，密封后室溫下貯存，并定期取0.1 mL加入到10 mL的NB培養(yǎng)液中，測(cè)定其芽孢存活率。

乳化劑：將選出的最佳溶劑油取10 mL置于小錐形瓶中，分別加入1 mL的吐溫-80，OP-10及吐溫-80和OP-10（體積比為1∶1）的混合物，再向其中加入1 mL的發(fā)酵液，振蕩均勻后，測(cè)定芽孢存活率。每隔7 d取0.1 mL分別加入到10 mL不同濃度的最佳乳化劑中，振蕩均勻后測(cè)定芽孢存活率。

以上各處理均在（25±1）℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定并記錄不同時(shí)間芽孢存活率，以芽孢存活率的高低判定溶劑油優(yōu)劣以及測(cè)定不同乳化劑對(duì)芽孢活性的影響。

1.3.3.2 抗生素的篩選 將已經(jīng)篩選出的溶劑油和乳化劑的最佳配比與生防菌Ht-q6發(fā)酵液混合制成乳液，然后將不同抗生素按照質(zhì)量濃度為5，15，25，50 μg/mL加到乳液中。將番茄早疫病菌孢子懸浮液均勻涂布在PDA平板上，自然晾干后在平板中央打一直徑為5 mm的孔。用移液槍取5 μL上述處理的乳液于孔中，每個(gè)處理3次重復(fù)，以不加抗生素的乳液作為對(duì)照。將所有平板置于（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.3.3 防凍劑的篩選 取1 mL不同防凍劑分別加入到10 mL生防菌Ht-q6發(fā)酵液中充分混合，稀釋后取0.5 mL均勻涂布于NA平板上，以不加防凍劑的發(fā)酵液為對(duì)照組，每個(gè)處理3次重復(fù)。置于恒溫培養(yǎng)箱中（25±1）℃下培養(yǎng)，3 d后采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定芽孢存活率，篩選最佳防凍劑。將篩選出的防凍劑，按2%，4%，6%，8%和10%等5種濃度分別與發(fā)酵液10 mL混合，以蒸餾水為對(duì)照，對(duì)照組始終置于（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，各處理前24 h置于（0±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后與對(duì)照組的培養(yǎng)條件一致，培養(yǎng)3 d后記錄芽孢存活率，篩選出最佳防凍劑濃度。

1.3.3.4 潤(rùn)濕劑和穩(wěn)定劑的篩選 將4種潤(rùn)濕劑（10%）和4種穩(wěn)定劑（2%）分別添加到已經(jīng)篩選出的上述配方中，測(cè)定添加潤(rùn)濕劑和穩(wěn)定劑后的懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間和芽孢存活率，每個(gè)處理3次重復(fù)，以不加潤(rùn)濕劑和穩(wěn)定劑的配方為對(duì)照，篩選出最佳潤(rùn)濕劑和穩(wěn)定劑。

1.3.3.5 保護(hù)劑的篩選[17]將4種保護(hù)劑按10%分別加到已制備的乳懸劑中，測(cè)定添加保護(hù)劑的懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間，以不加保護(hù)劑為對(duì)照，在254 nm紫外燈下距離40 cm處照射6，12，24 h后計(jì)算芽孢存活率。

1.3.4 生防菌Ht-q6乳懸劑貯藏時(shí)間的測(cè)定 取2 mL試樣和18 mL的無菌水置于100 mL的錐形瓶?jī)?nèi)，振蕩均勻。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，每隔6 d測(cè)1次，當(dāng)活菌數(shù)出現(xiàn)大量減少時(shí)，改為每隔3 d測(cè)一次，直到活菌數(shù)接近于零，記錄測(cè)量間隔時(shí)間及活菌數(shù)。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出1 mL樣品中的活菌數(shù)。

1.3.5 生防菌Ht-q6芽孢存活率的測(cè)定 參考《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)》（GB 4789.2—2010），采用平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)定制劑的芽胞含量。即將乳懸劑按10倍梯度依次稀釋7次后，取最后稀釋液0.1 mL均勻涂布于平板上，計(jì)算菌落數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算菌株存活率（SC）。

其中，M為含生防菌的乳懸劑在NA平板上的菌落數(shù)（cfu/g）；M0表示未添加任何助劑的生防菌在NA平板上的菌落數(shù)（cfu/g），即空白對(duì)照。

1.3.6 生防菌Ht-q6乳懸劑質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定 按照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)生防菌Ht-q6乳懸劑的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，如傾倒性、熱貯穩(wěn)定性、低溫穩(wěn)定性、雜菌率、pH和細(xì)度。

傾倒性的測(cè)定按HG/T2467.5—2003方法。熱穩(wěn)定性的測(cè)定按GB/T 19136—2003方法。低溫穩(wěn)定性的測(cè)定按GB/T 19137—2003方法。懸浮率的測(cè)定按照GB/T 14825—2006方法；pH值測(cè)定按照GB/T1601—1993方法。

1.3.7 生防菌Ht-q6乳懸劑安全性評(píng)價(jià)

1.3.7.1 對(duì)番茄植株的安全性測(cè)定 用接種針蘸取生防菌Ht-q6乳懸劑10倍稀釋液直接穿刺接種番茄葉片和莖部，保濕培養(yǎng)，以穿刺接種無菌水作為對(duì)照。然后將番茄苗的根部洗凈，浸根于菌懸液中接種，再將番茄苗移栽至含無菌土的育苗缽中，常規(guī)管理；以根部浸于無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理5株番茄（5～6片葉），3次重復(fù)。

1.3.7.2 毒理學(xué)測(cè)定 依據(jù)國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15670.2—2017，以大鼠為材料，通過急性經(jīng)口毒性、急性經(jīng)皮毒性和急性皮膚刺激試驗(yàn)，測(cè)試生防菌Ht-q6乳懸劑對(duì)大鼠的安全性[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑油與乳化劑的篩選結(jié)果

從表1可以看出，芥末油在21 d后芽孢存活率為0，效果最差。花生油處理的芽孢存活率與其他處理相比，僅在7，14 d時(shí)與芝麻油處理的差異不顯著，其余時(shí)間段與其他處理間差異顯著。故確定花生油為最佳溶劑油。

表1 室溫下不同溶劑油對(duì)芽孢存活率的影響

從表2可看出，14 d之前芽孢存活率在66%～100%，其中，OP-10對(duì)芽孢的存活率影響最低，與其他處理差異顯著。14 d之后吐溫-80與OP-10混合乳化劑對(duì)芽孢存活率的影響減小，與其他處理相比差異顯著，確定選擇該混合物作為乳化劑。由圖1可知，芽孢存活率隨乳化劑添加比例的升高而降低，確定0.2%為混合乳化劑的最佳添加比例。

表2 室溫下不同乳化劑對(duì)芽孢存活率的影響

2.2 抗生素的篩選

由表3可知，隨著3種抗生素質(zhì)量濃度的增加，對(duì)番茄早疫病菌抑制作用逐漸增強(qiáng)。其中，加入15 μg/mL的制霉菌素和兩性霉素，對(duì)番茄早疫病菌抑制作用較好且與對(duì)照差異不顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，對(duì)乳液的抑菌效果有增效作用?？紤]到價(jià)格和用量問題，最終確定15 μg/mL的制霉菌素添加于生防菌Ht-q6乳懸劑中。

2.3 防凍劑的篩選

由圖2可知，添加丙二醇和丙三醇的處理，芽孢存活率分別為12.2%和19.4%，與其他處理相比具有顯著性差異；氯化鈣、乙醇和乙二醇與對(duì)照相比，對(duì)芽孢存活率的影響較小。由此得出，氯化鈣、乙醇和乙二醇適合作為防凍劑。

從表4可以看出，當(dāng)防凍劑濃度小于6%時(shí)，隨防凍劑濃度的增加對(duì)芽孢的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)乙二醇濃度為6%時(shí)，芽孢存活率最高，達(dá)到85.4%，與其他處理差異顯著，但與對(duì)照差異不顯著。因此，確定6%的乙二醇作為乳懸劑的防凍劑。

表4 防凍劑對(duì)芽孢的保護(hù)作用

2.4 潤(rùn)濕劑、穩(wěn)定劑的篩選

從表5可以看出，十二烷基苯磺酸鈉的懸浮率為65.6%，與其他處理相比差異顯著；潤(rùn)濕時(shí)間為28.5 s與洗衣粉差異不顯著并且芽孢存活率最高，為89.1%。在田間潤(rùn)濕時(shí)間越短越能發(fā)揮藥效，最終確定十二烷基苯磺酸鈉作為乳懸劑的潤(rùn)濕劑。

表5 潤(rùn)濕劑對(duì)Ht-q6乳懸劑的影響

從表6可以看出，KH2PO4的懸浮率為77.6%，與其他處理相比差異顯著，潤(rùn)濕時(shí)間為41.4 s，與K2HPO4差異不顯著。綜合分析潤(rùn)濕時(shí)間以及對(duì)芽孢存活率的影響，選擇效果最佳的KH2PO4為穩(wěn)定劑。

表6 穩(wěn)定劑對(duì)Ht-q6乳懸劑的影響

2.5 保護(hù)劑的篩選

由表7可知，抗壞血酸的懸浮率為76.2%，潤(rùn)濕時(shí)間為（37.4±1.8）d，與其他處理間差異顯著，懸浮效果與潤(rùn)濕性能最好；抑菌圈直徑與對(duì)照組差異不顯著且添加抗壞血酸后對(duì)芽孢活性影響小，確定最佳紫外保護(hù)劑為抗壞血酸。

2.6 生防菌Ht-q6乳懸劑質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果分析

制劑外觀為可流動(dòng)的乳白色黏稠液體；貯存過程中有少量沉淀或微分層，經(jīng)搖動(dòng)能恢復(fù)原狀，無結(jié)塊。由表8可知，出生防菌Ht-q6乳懸劑的芽孢含量為2.54×109cfu/mL，雜菌率為0.85%，pH值為7.2，細(xì)度為96.5%，懸浮率為90.5%，傾倒性、低溫穩(wěn)定性和熱貯穩(wěn)定性都符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值，質(zhì)量合格。

表7 4種紫外保護(hù)劑對(duì)Ht-q6乳懸劑的影響

表8 生防菌Ht-q6乳懸劑質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.7 生防菌Ht-q6乳懸劑貯藏時(shí)間的測(cè)定結(jié)果分析

從圖3可以看出，生防菌Ht-q6乳懸劑的活菌量在貯藏前54天時(shí)變化不明顯，減少幅度較小，從54 d開始活菌量變化幅度增大，當(dāng)貯藏80 d時(shí)含量接近于零，說明乳懸劑的有效貯藏時(shí)間為80 d左右，而在54 d之內(nèi)使用效果最佳。

2.8 生防菌Ht-q6乳懸劑安全性測(cè)定結(jié)果

2.8.1 乳懸劑對(duì)番茄植株的安全性測(cè)定 結(jié)果表明，番茄葉片和莖稈用接種針穿刺接種培養(yǎng)3 d后，與對(duì)照組沒有明顯差異，番茄植株經(jīng)乳懸劑100倍稀釋液多次澆灌后，無發(fā)病狀況。確定生防菌Ht-q6乳懸劑對(duì)番茄植株沒有致病性。

2.8.2 乳懸劑毒理學(xué)測(cè)定 急性經(jīng)口毒性和急性經(jīng)皮毒性測(cè)試表明，該乳懸劑屬于低毒性。在急性皮膚刺激試驗(yàn)周期內(nèi)，試驗(yàn)鼠的皮膚涂抹部位未出現(xiàn)紅斑、水腫，表明乳懸劑對(duì)皮膚沒有刺激性。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對(duì)溶劑油、乳化劑、防凍劑和抗生素等助劑的篩選，確定了生防菌Ht-q6乳懸劑的最佳配方。經(jīng)檢測(cè)，制劑的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)達(dá)到國(guó)家要求，毒性測(cè)試表明該乳懸劑屬于低毒性，產(chǎn)品配方成本經(jīng)濟(jì)，加工工藝簡(jiǎn)單，質(zhì)量穩(wěn)定，為其他生防菌劑助劑的開發(fā)提供了參考。由于乳懸劑在農(nóng)藥制劑中發(fā)展歷史較短，并處于不斷完善中，故在產(chǎn)量上仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乳油和可濕性粉劑[19]。

與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)乳懸劑的研究技術(shù)仍然存在很多問題，農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)的自主研發(fā)能力較弱，國(guó)內(nèi)現(xiàn)行產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中許多技術(shù)指標(biāo)與國(guó)外現(xiàn)行產(chǎn)品存在較大差距。如國(guó)內(nèi)的懸浮率在85%以上，而國(guó)外一般達(dá)到95%以上。這直接影響了制劑的儲(chǔ)存時(shí)間，同樣也是阻礙此劑型推廣應(yīng)用的一大技術(shù)性難題[20]。本試驗(yàn)制備的乳懸劑有效貯藏時(shí)間（約80 d）與其他芽孢桿菌生防菌劑的有效貯藏時(shí)間（約100 d）相比有些短。因此，為了保持制劑防效和提高貯藏時(shí)間，在制備乳懸劑時(shí)還需要不斷調(diào)整制劑中所添加的助劑種類及范圍。如李農(nóng)昌等[21]在對(duì)白僵菌油劑劑型的研究中還分別對(duì)抗氧劑、增效劑、稀釋劑進(jìn)行篩選。此配方的實(shí)用性有待田間試驗(yàn)證實(shí)。