周霖，張鈺萍，何麗，尤倩，彭飛，吳意

（1.湖南師范大學附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.湖南省郴州市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科，湖南 郴州 423000；3.湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410013）

近年來，國內乳腺癌（breast cancer,BC）發(fā)病率呈逐年上升趨勢，居于女性惡性腫瘤之首，發(fā)病率最高的是經(jīng)濟發(fā)達的沿海城市[1-2]。近幾年有學者研究稱細胞縫隙連接蛋白43（connexin 43,Cx43）在人類多種腫瘤的產(chǎn)生、生長及預后中發(fā)揮不可缺少的作用[4]。國內外都有相關研究報道Cx43表達和乳腺癌的臨床病理特征存在著某種關聯(lián)，但得到的結論卻不全然相同[5-8]。本研究通過Meta分析為乳腺癌的防治奠定循證醫(yī)學證據(jù)，從而探索開辟出一條新的道路。

1　資料與方法

1.1　文獻檢索策略

檢 索 PubMed、Embase、Web of Science、 循 證醫(yī)學數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)及萬方數(shù)據(jù)庫公開發(fā)表的文章，截止時間為2017年4月，加以文獻追溯、手工檢索等方法查找Cx43表達與乳腺癌相關的文獻，檢索語種限定為中文和英文，中文檢索關鍵詞為乳腺癌和縫隙連接蛋白43，英文檢索關鍵詞為breast cancer、BC、breast carcinoma、mammary cancer、connexin43及Cx43。納入標準：①研究對象為人類的對照研究；②在國內外公開發(fā)表，提供原始數(shù)據(jù)的Cx43表達與乳腺癌病理特征關系相關的對照研究分析；③所有患者有完整的臨床病理資料；④Cx43檢測方法為免疫組織化學染色法，且評分標準一致等；⑤各參考文獻研究方法及研究問題相似。排除標準：①沒有提供原始數(shù)據(jù)的綜述；②未設立對照組；③Cx43檢測方法為非免疫組織化學染色法及陽性判斷標準不一致者；④反復發(fā)表、資料相近及質量較粗糙等沒法使用的文件資料；⑤未提及臨床病理因素，也無預后結果，如整體生存率、5年存活率等。

1.2　質量評價

參照紐卡斯爾渥太華量表（newcastle-ottawa scale,NOS）設立質量評價體系，對歸入研究進行質量衡量。衡量內容主要包括以下3個基點：病例選擇性、基線可比性及暴露原因，共8個條目，每個條目給分點為1～2分，每篇研究評價得分為0～9分。如果總分≥6分，則認為研究文獻內容較好，若總分＜6分，則該文獻不歸入研究。見表1。

1.3　文獻篩選及數(shù)據(jù)提取

根據(jù)檢索策略進行文獻檢索，先通過閱讀標題和摘要進行文獻初篩，然后閱讀全文，依照納入與排除標準進行篩選。最后有14篇文獻被納入，其中一共有1 039例研究樣本量，應抽取的關鍵點主要包含：編號、文題、第一作者姓名、出版時間、所在地、檢測樣本總數(shù)、研究方法、乳腺癌及其TNM分期、組織學分級、淋巴結轉移及Cx43表達相關預后指標（如5年存活率和整體生存率等）。納入文獻免疫組織化學陽性依據(jù)：細胞染色≥10%的標本為陽性者。

1.4　文獻篩選結果

應用上述文獻檢索方法，共計檢索到90篇文獻。通過閱讀標題及摘要排除掉50篇（包括動物實驗文獻、非乳腺癌研究、非生物分子類研究、綜述文獻及重復性文獻等），再對剩下的文獻通過全文分析，刪除掉12篇文獻，對二次納入的28篇文獻進行仔細閱讀，排除掉Cx43分子研究法和免疫組織化學法對陽性結果評分標準不一致的文獻14篇，最終納入研究的文獻為14篇，其中＞10篇文獻以亞洲人種為主[13-15，19]。見表2。

1.5　納入研究的特征及質量評價結果

最終納入的14篇文文獻均以免疫組織化學法作為Cx43的研究方法，此外，每篇納入的文獻的NOS評分≥7分，說明納入的文獻質量均較高。見表3。

表1　NOS質量評價表

表2　納入文獻特征

1.6　統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用Review Manager 5.3統(tǒng)計軟件，計算出相關評價指標優(yōu)勢比（odds ratio,OR），95%置信區(qū)間（confidential interval,CI）成為效應量顯示成果。臨床異質性：按照納入與排除標準及文獻質量評分量表篩除掉低質量文獻，減少臨床異質性。統(tǒng)計學異質性：首先對納入的原始文獻進行Q檢驗，I2檢驗來評估納入研究間的異質性，根據(jù)異質性檢驗結果（P值，I2值）選擇固定效應模型或隨機效應模型求得效應合并值。若P＞0.05，I2＜50%，能夠作為多個單獨研究間不存在異質性，則選用固定效應模型來分析。若P＜0.05，I2＞50%，闡明了多個研究之間擁有異質性，需從研究對象特點，預防手段的變化情況等角度分析異質性存在的緣由，必要時需采用敏感性分析或亞組分析等異質性處理方案詮釋，經(jīng)處理后如果沒有異質性，再擬用固定效應模型。若是未挖掘出異質性源頭，就擬用隨機效應模型。如果通過分析發(fā)現(xiàn)異質性來源，需要對納入排除標準及文獻質量再次做出評估，并進行敏感性分析，隨意剔除單個文獻，重新進行Meta分析，觀測合并指標變化與否來檢驗分析結果的平穩(wěn)性，若異質性顯著存在，則放棄Meta分析，若解決了異質性來源，則擬用相對應的模型進行分析。最終分析結果通過繪制森林圖來評價效應量，通過漏斗圖檢測發(fā)表偏倚是否存在。

表3　納入文獻質量評價結果

2　結果

2.1　乳腺癌與正常乳腺組織Cx43陽性表達率的比較

9個原始研究進行了Cx43在乳腺癌組織與正常乳腺組織陽性表達率的比較，其中乳腺癌組有632例，正常乳腺組織組有240例[8-9，13-19]。通過異質性檢驗，提示兩研究結果間無異質性故采用固定效應模0.10）]。乳腺癌 Cx43陽性表達率為 40.51%（256/632），正常乳腺組織陽性表達率為92.50%（222/240），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.910，P=0.000），乳腺癌組織中Cx43陽性表達率低于正常乳腺組織。Cx43陽性表達率在乳腺癌組織和乳腺正常組織的比較研究中存在一定的發(fā)表偏倚。見圖1、2。

圖1　乳腺癌與正常乳腺組織Cx43陽性表達率比較森林圖

圖2　乳腺癌與乳腺正常組織Cx43陽性表達比較的漏斗圖

2.2　乳腺癌與乳腺增生組織Cx43陽性表達率比較

4篇文獻歸入探討Cx43在乳腺癌與乳腺增生組織陽性表達率的研究對比，乳腺癌組被歸入244例，乳腺組織增生組被歸入167例[11，14-15，19]。兩組通過進行異質性檢驗，差異有統(tǒng)計學意義故選用隨機效應模型乳腺癌中Cx43陽性表達率為42.62%（104/244），乳腺增生組織Cx43陽性表達率為87.43%（146/167），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=2.680，P=0.007），乳腺癌組織Cx43陽性表達率低于乳腺增生組織。漏斗圖基本呈不對稱分布，展示出Cx43陽性表達率在乳腺癌和乳腺增生組織的比較研究中存在發(fā)表偏倚。見圖3、4。

2.3　乳腺癌組織TNM Ⅲ、Ⅳ期與TNMⅠ、Ⅱ期的Cx43陽性表達率比較

4篇研究納入Cx43在乳腺癌組織TNMⅢ、Ⅳ期與TNMⅠ、Ⅱ期表達陽性表達率的比較，其中乳腺癌組織TNMⅢ、Ⅳ期91例，乳腺癌組織TNMⅠ、Ⅱ期組有 217 例[11，15，17，19]。通過進行異質性檢驗，差異無統(tǒng)計學意義故選用固定效應模型乳腺癌TNMⅢ、Ⅳ期Cx43陽性表達率為25.27%（23/91），TNMⅠ、Ⅱ期Cx43陽性表達率為47.93%（104/217），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.080，P=0.000），Cx43在乳腺癌組織TNMⅢ、Ⅳ期中的陽性表達率低于乳腺癌組織TNMⅠ、Ⅱ期。漏斗圖基本呈對稱分布，展示出Cx43陽性表達率在乳腺癌不同TNM分期的比較研究中存在較小的發(fā)表偏倚。見圖5、6。

圖3　乳腺癌與乳腺增生組織Cx43陽性表達率比較森林圖

圖4　乳腺癌與乳腺增生組織Cx43陽性表達比較的漏斗圖

圖5　乳腺癌組織TNMⅢ、Ⅳ期與TNMⅠ、Ⅱ期Cx43陽性表達率比較森林圖

圖6　乳腺癌TNMⅢ、Ⅳ期與TNMⅠ、Ⅱ期Cx43陽性表達率比較的漏斗圖

2.4　乳腺癌組織學分級Ⅲ級與Ⅰ、Ⅱ級的Cx43陽性表達率比較

乳腺癌組織學分級主要從腺管多少、細胞核異質性及核分裂情況3個方面評價。一直以來，乳腺癌分化程度和其預后情況備受醫(yī)學界關注。乳腺癌惡性程度與組織學分級成正比，與分化程度呈反比。總共有7篇文獻被歸入Cx43在乳腺癌組織學分級Ⅲ級與Ⅰ、Ⅱ級中陽性表達率的對比研究，其中乳腺癌組織學分級Ⅲ級標本有267例，乳腺癌組織學分級Ⅰ、Ⅱ級標本有356例[11，15，17-19，20，24]。通過進行異質性檢驗，差異無統(tǒng)計學意義故選用隨機效應模型Cx43 在乳腺癌組織學分級Ⅲ級中的陽性表達率為35.58%（95/267），在乳腺癌組織學分級Ⅰ、Ⅱ級中的陽性表達率為49.10%（174/356），兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=2.750，P=0.006），Cx43在乳腺癌組織學分級Ⅲ級中的陽性表達率低于組織學分級Ⅰ、Ⅱ級。漏斗圖基本呈不對稱分布，展示出Cx43陽性表達率在乳腺癌組不同組織學分級的比較研究中存在一定的發(fā)表偏倚。見圖7、8。

圖7　乳腺癌組織學分級Ⅲ級與Ⅰ、Ⅱ級Cx43陽性表達率比較森林圖

圖8　乳腺癌組織學Ⅲ級與Ⅰ、Ⅱ級Cx43陽性表達率比較的漏斗圖

2.5　乳腺癌組織中有無淋巴結轉移的Cx43陽性表達率比較

8篇文獻納入研究比較Cx43在乳腺癌組織中有無淋巴結轉移的陽性表達率，其中乳腺癌組織有淋巴結轉移組有351例，乳腺癌組織無淋巴結轉移組有311例[10-11，14-15，17，19-20，24]。通過進行異質性檢驗，差異有統(tǒng)計學意義故選用隨機效應模型Cx43在乳腺癌組織有淋巴結轉移中陽性表達率為44.73%（157/351），在乳腺癌組織無淋巴結轉移中陽性表達率為46.30%（144/311），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Cx43在乳腺癌組織有無淋巴結轉移中的陽性表達率沒有意義。漏斗圖呈不對稱分布，展示出Cx43陽性表達率在乳腺癌組織中有沒有淋巴結轉移的比較研究中存在某個范圍上的發(fā)表偏倚，或許會造成對局部試驗成果的準確性及穩(wěn)定性產(chǎn)生某種程度上的影響。見圖9、10。

圖9　乳腺癌組織中有無淋巴結轉移Cx43陽性表達率比較森林圖

圖10　乳腺癌中有無淋巴結轉移的Cx43陽性表達率比較的漏斗圖

3　討論

腫瘤的生長由多因素多環(huán)節(jié)參與，是一個漫長的的變化過程，由癌基因和抑癌基因調控著的細胞增殖與凋亡相互作用的成果，它們之間的動態(tài)平衡保持著人體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和人體構造組分的正常生長、發(fā)育。一般來講，在正常情況下，乳腺組織中的細胞生長增殖與細胞凋亡（即細胞程序化死亡）在有條不紊、相應均衡地發(fā)展，進而維持乳腺組織正常孕育、發(fā)育及分化，保持腺體正常的形態(tài)和功能[25]。當在外因與內因相互作用下機體失衡便會引起腫瘤的發(fā)生。就現(xiàn)在而言，女性惡性腫瘤的頭號殺手變成了乳腺癌，是脅迫女性生命健康的重要疾病之一，到現(xiàn)在為止，乳腺癌發(fā)病率仍呈現(xiàn)出增高的走勢，大概占全部癌癥的15%[26]。

每一個機體和組織都存在著不一樣的連接蛋白亞型，可以演變成具備差別功能的連接子。連接子的重要組分是間隙連接蛋白，它的六聚體能夠構成1個連接子[27]。2個連接子演化成1個間隙鏈接（細胞間通道），通過介入細胞間物質交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳導的電偶聯(lián)，能夠讓細胞間發(fā)生物質、能量及信息互換，并管控著細胞的新陳代謝、細胞的增殖、分化和內環(huán)境的安穩(wěn)秩序等生理歷程[28]。腫瘤表型和聯(lián)接通道蛋白表達減少及細胞間隙聯(lián)通受損有很大關聯(lián)[29]。有研究者提出，Cx43在肝癌、肺癌及前列腺癌中均減少，在人類乳腺上皮細胞及乳腺癌組織中也都有產(chǎn)生，并在上皮細胞分化，癌變歷程中發(fā)揮關鍵作用[30]。Cx43可通過開啟子甲基化、C末端氨酸殘基磷酸化等渠道產(chǎn)生下調來抑制乳腺腫瘤細胞的增殖、弱化腫瘤的侵襲力，且有不少研究表明Cx43表達與一些預后因子如腫塊大小、淋巴結轉移及組織學分級等臨床病理特征相關[23，30]。但所得的結論都頗有爭議，該分子的發(fā)現(xiàn)及研究價值為越來越多的研究者所探討，有望能夠為乳腺癌的治療及預后提供可靠指標，為乳腺癌患者帶來福音。但是目前，國內外仍沒有相關文獻研究報道Cx43能否成為乳腺癌預后的獨立因素來評價乳腺癌患者的病情。因此本文決定收集整理大批量文獻資料，用于數(shù)據(jù)整合匯總，采用Meta分析定量統(tǒng)計，為Cx43分子對乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預后有無重大的研討意義提供循證醫(yī)學根據(jù)。

從現(xiàn)有的許多研究可見，乳腺癌組織中Cx43表達程度可能與Cx43檢測方法有關，但大量數(shù)據(jù)研究結果都顯示Cx43在乳腺癌組織中低表達。在乳腺癌產(chǎn)生生長的所有過程中都串聯(lián)著Cx43低表達或不表達，卻在正常乳腺組織和乳腺增生組織中高表達，與本文Meta分析結果相符[31]。在乳腺癌組織中，Cx43表達減弱或缺失，機體對細胞的監(jiān)管和管控能力就會削弱，使得細胞間通信交流異常，導致腫瘤細胞過度克隆增殖。Cx43產(chǎn)生減少只是表達梯度的降低，并不是遺傳因子的畸變或缺失，在正常乳腺組織和乳腺良性增生組織中Cx43高表達，有利于細胞間通信鏈接的拼裝，鞏固細胞之間的信號交換，使得細胞間的生長彼此被抑止，從而維持細胞的正常形態(tài)和功能[31]。此外，有很多研究涉及到Cx43表達與淋巴結轉移情況、遠端轉移情況、腫塊大小、腫瘤分期、組織學分級及病理分期等很多預后因子的干系，希望通過這些探索研究確定Cx43能否成為乳腺癌有意義的預后因子。張光謀、張立英及高一菁等在研究中均表明乳腺癌組織中Cx43表達與TNM分期密切相關，TNMⅢ、Ⅳ期表達陽性率低于TNMⅠ、Ⅱ期[11，14-15，17]。TNM一般來講腫瘤分期與腫瘤進展情況、惡劣程度成正相關，初期腫瘤比后期腫瘤預后效果相對要好。本文Meta分析結果顯示，Cx43在乳腺癌不同TNM分期中表達有差異，說明Cx43表達下調表現(xiàn)在乳腺細胞癌變的全過程，Cx43表達水平越低可能提示乳腺腫瘤惡性程度越高。在具有相同臨床分期的乳腺癌中，組織學分級越高，患者的5年存活率越低，Cx43在乳腺癌不同組織學分級中的表達可能衍變?yōu)?個險要成分，但各項研究結果卻不盡相同。ZHOU、張光謀及高一菁等[11，14-15，18，20]研究發(fā)現(xiàn) Cx43表達與組織學分級密切相關，隨著乳腺癌組織學分級增高而不斷減弱。而FU等[24]認為Cx43表達在不同組織學分級沒有差別。本文Meta分析研究結果顯示，Cx43在乳腺癌組織中組織學分級Ⅲ級表達陽性表達率低于組織學分級Ⅰ、Ⅱ級，提示Cx43在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及細胞分化中發(fā)揮著重要的作用，腫瘤分化能力越差提示惡性程度越高，Cx43表達就越低。淋巴結轉移是指脫落腫瘤細胞到達匯流區(qū)淋巴結，并以此圍繞成長出相同癌細胞的表象形式，它是最為常見的腫瘤轉移方式。乳腺癌淋巴結轉移與許多種因素息息相關，Cx43表達下調有沒有提示乳腺癌有淋巴結轉移，研究所得結論尚且存在著差異，KANCZUGAKODA等[10]以為Cx43表達與乳腺癌有無淋巴結轉移密切相關，甚至在乳腺癌有淋巴結轉移組織中高表達，張光謀、張立英及高一菁等[11，14-15，17，20]則以為 Cx43 在乳腺癌有淋巴結轉移組織中低表達。而FU、涂永久等研究卻認為Cx43表達與乳腺癌有無淋巴結轉移無差異。本文Meta分析結果顯示，Cx43在乳腺癌組織中有沒有淋巴結轉移情況下陽性表達率沒有關系。出現(xiàn)這種結果差異的原因可能是Cx43檢測方法雖為免疫組織化學法，但是所使用的抗體試劑廠家不同，如KANCZUGA-KODA使用的是多克隆山羊Cx43抗體（1∶200稀釋；上海圣克魯斯生物技術有限公司），高一菁利用的是兔抗人Cx43多克隆抗體（ZA-0444，即用型，北京中杉金橋生物技術公司）。張光謀研究使用的是SP免疫組織化學法（生物素檢測系統(tǒng)），高一菁用的是Elivision免疫組織化學法（非生物素檢測系統(tǒng)），均對結果產(chǎn)生一定的影響[10-11，14-15]。

本研究的不足之處：納入研究的文獻總體來說數(shù)量較少，數(shù)據(jù)收集存在一定的局限性，可能會影響Meta分析結果的可信度。本文缺少灰色文獻，在分析過程中不可避免的存在各種偏倚，最常見的就是發(fā)表偏倚和語言偏倚。一般地，由于研究結果的目標性太強導致不可能包含全部相干研究，那么，那些預防操作和結果顯著懸殊的研究（即陽性成績）就很容易被發(fā)布，而那些陰性結果的研究通常會被忽視。當存在發(fā)表偏倚時，需要用漏斗圖檢測識別，當文獻樣本量少時，數(shù)據(jù)分散分布在漏斗圖底部，研究精確度低。所以，一般納入研究文獻要求≥10篇，才有研究意義。其次，還存在語言偏倚，本文所檢索文獻沒有除去英文和中文以外的文獻，這也會對研究文獻的綜合性和科學性產(chǎn)生影響。

當兩組研究間有著異質性時，可以采用用隨機效應模型處理數(shù)據(jù)，但當異質性＞75%時，一般情況下不建議進行文獻合并，需要先進行亞組分析或者回歸剖析解決異質性。再者，Meta分析本身有一些方法學缺陷都會對結果產(chǎn)生一定的影響，基于上述幾點原因，本文Meta分析結果只能作為估測結論，尚且有待用大規(guī)模的、前瞻性的研究輔以證實。故有待于設計更嚴謹科學的高質量研究方案，來進一步落實Cx43分子表達與乳腺癌的關聯(lián)，用更嚴明的依據(jù)來闡明乳腺癌防治的分子機制。

綜上所述，可見Cx43低表達可以增強乳腺腫瘤的增殖、侵襲能力，降低組織分化能力說明Cx43在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，可以作為乳腺癌治療及預后的參考指標之一，為臨床上乳腺癌治療及預后評估提供更多依據(jù)，并具有成為乳腺癌藥物靶點治療的潛能。