石萬萍 李桂香

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院伽馬刀科，甘肅蘭州 730000

肺癌每年新發(fā)病例約70.5萬，死亡病例約56.9萬[1]。其中，NSCLC占肺癌總?cè)藬?shù)的80%～85%，大約75%的NSCLC患者在確診時已為晚期（Ⅲ～Ⅳ期）[2]，錯失了最佳手術(shù)時機[3]，導(dǎo)致NSCLC的生存率低、死亡率高，因此，肺癌的早期診斷、合理治療是延長NSCLC生存期，減少死亡率的有效措施之一。本文選取蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院2016年3～10月期間經(jīng)病理證實的NSCLC患者70例，進行端粒長度與NSCLC病理類型、臨床分期、吸煙情況、年齡、KI-67等因素的分析比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院2016年3～10月期間經(jīng)氣管鏡活檢或穿刺活檢，病理為腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌等NSCLC患者70例，男56例，女14例，男女比例為4∶1。年齡27～83歲，平均（59.4±8.7）歲，采集患者清晨空腹外周靜脈抗凝全血2mL，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；同時收集相關(guān)病例資料，主要包括姓名、病理診斷、性別、年齡、TNM分期、細(xì)胞核相關(guān)抗原（nuclear associated antigen ，Ki-67）陽性細(xì)胞數(shù)表達水平等。同時，選取同期在蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院體檢中心健康體檢者40例為對照組，其中男32例，女8例，男女比例為4：1，平均年齡（59.1±5.2）歲，采集患者清晨空腹外周靜脈抗凝全血2mL，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 非小細(xì)胞肺癌組與健康對照組年齡、性別的比較

1.2 外周血端粒長度的測定

應(yīng)用 Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）實時熒光定量試劑盒對每個樣本分別進行端粒Tel和單拷貝基因36B4擴增，兩個基因均做4個重復(fù)管，擴增完成后， ABI（7500）實時熒光定量 PCR儀自帶分析軟件可以分析得到所測樣品的熒光起始循環(huán)數(shù)（Ct值）。根據(jù)Ct值計算該樣本的相對端粒長度。計算原理參照曹東維[4]和Richard M.Cawthon[5]計算原理，每經(jīng)過1個循環(huán)擴增，PCR 產(chǎn)物量增加翻倍，端粒與單拷貝基因的比率及T/S比率為ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示外周血端粒長度。根據(jù)此公式可計算出每個樣本的相對T/S值，該值與樣品 DNA 的RTL相對應(yīng)。

1.3 其他檢查指標(biāo)

腫瘤TNM分期參照國際肺癌研究協(xié)會2009年制定非小細(xì)胞肺癌TNM分期（第7版）分期標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)移情況依據(jù)影像學(xué)（CT或MR）檢查結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0版對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組計量資料比較采用F檢驗，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者與對照組年齡、性別上的比較

在年齡、性別、吸煙等方面，肺癌組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可以進行相關(guān)指標(biāo)的比較，同時，肺癌組外周血端粒長度較對照組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組間吸煙情況對外周血RTL的影響

肺癌組與對照組吸煙人數(shù)分別為37、22例，吸煙組均較不吸煙組外周血端粒長度明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 吸煙對外周血端粒長度的影響（±s）

表2 吸煙對外周血端粒長度的影響（±s）

吸煙情況 肺癌組 對照組n 端粒長度 n 端粒長度吸煙 37 1.28±0.39 22 2.53±1.01不吸煙 33 1.53±0.47 18 4.58±1.87 t 2.43 6.25 P＜0.05 ＜0.05

2.3 兩組間年齡對外周血端粒長度的影響

將肺癌組與對照組以年齡＞60歲與年齡≤60歲進行分組，兩組進行比較，比較結(jié)果如下表3所示，年齡＞60歲的群體端粒長度均短于年齡≤60歲群體，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 年齡對端粒長度的影響（± s）

表3 年齡對端粒長度的影響（± s）

年齡分組 肺癌組 對照組n 端粒長度 n 端粒長度＞60歲 25 1.20±0.37 22 3.03±1.37≤60歲 45 1.51±0.45 18 4.27±1.75 t 2.94 2.52 P＜0.05 ＜0.05

2.4 不同臨床分期非小細(xì)胞肺癌患者端粒長度的比較

根據(jù)國際肺癌研究協(xié)會2009年制定非小細(xì)胞肺癌TNM分期（第7版）標(biāo)準(zhǔn)，將NSCLC患者分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，Ⅰ+Ⅱ期為早期，Ⅲ+Ⅳ期為晚期，分別對早、晚期患者外周血RLT進行比較，由表4可以看出：經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，臨床分期越晚端粒相對長度越短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 非小細(xì)胞肺癌端粒長度與肺癌的原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的比較

參照國際肺癌研究協(xié)會2009年制定非小細(xì)胞肺癌TNM分期（第7版），對NCSLC組進行TNM分期，原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況分別與外周血端粒長度進行分組比較，原發(fā)灶（T）越大，端粒長度縮短越明顯，原發(fā)灶與端粒長度呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（N）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況（M）均與端粒長度不相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表4 不同分期非小細(xì)胞肺癌組端粒長度的比較（±s）

表4 不同分期非小細(xì)胞肺癌組端粒長度的比較（±s）

分期 n 端粒長度早期（Ⅰ+Ⅱ） 17 1.64±0.37晚期（Ⅲ+Ⅳ） 53 1.32±0.45 t 2.64 P＜0.05

表5 端粒長度與NSCLC的TNM分期比較（±s）

表5 端粒長度與NSCLC的TNM分期比較（±s）

注：臨床分期參照國際肺癌研究協(xié)會2009年制定非小細(xì)胞肺癌TNM分期（第7版）

臨床特征 n 端粒長度 F P原發(fā)灶大小 70 14.19 ＜0.05 T1 11 1.82±0.33 T2 21 1.63 0.33 T3 22 1.15±0.29 T4 16 1.15±0.47淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況 70 1.31 ＞0.05 N0 14 1.55±0.53 N1 16 1.44±0.45 N2 25 1.27±0.38 N3 15 1.41±0.45遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況 70 2.78 ＞0.05 M0 41 1.43±0.40 M1 29 1.36±0.51

2.6 端粒長度與Ki-67進行相關(guān)性分析

根據(jù)病理報告單統(tǒng)計非小細(xì)胞肺癌組Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)表達水平，分組與端粒長度進行相關(guān)性分析，其中7例在病理檢查時未做Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)檢查，故總病例數(shù)為63例。 Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)表達水平越低，端粒長度越長，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，端粒長度與Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)表達水平呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

3 討論

目前臨床上 NSCLC 早期診斷困難，缺乏有效的早期診斷生物標(biāo)志物，大部分NSCLC發(fā)現(xiàn)時已為晚期（Ⅲ+Ⅳ期），因此，提高 NSCLC 早期診斷率非常重要，特別是發(fā)現(xiàn)一種或多種無創(chuàng)或微創(chuàng)的檢測手段。其次，NSCLC做為一種常見的、多發(fā)的惡性腫瘤，診斷金標(biāo)準(zhǔn)主要依靠病理活檢，但是在臨床工作中，我們經(jīng)常遇到一些肺部占位患者，因占位部位較深，穿刺難度大，距離支氣管較遠(yuǎn)，無法行穿刺活檢或氣管鏡下活檢，獲取明確的組織病理結(jié)果難度大，確定腫瘤的良惡性困難。

表6 端粒長度與Ki-67相關(guān)性分析（±s）

表6 端粒長度與Ki-67相關(guān)性分析（±s）

Ki-67 n 端粒長度 F P Ki-67≤30% 21 1.68±0.49 12.47 ＜0.05 30%＜Ki-67＜60% 27 1.31±0.21 Ki-67≥60% 15 1.04±0.45

本研究中，通過對肺癌組、對照組分別行外周血端粒長度測定，兩組進行比較，結(jié)果：肺癌組外周血RTL較對照組明顯縮短差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果與閆振富等[6]研究結(jié)果，基本一致。譚善娟等[7]用Q-PCR 法檢測145例肺癌患者、145名正常對照和145名焦?fàn)t工人外周血基因組DNA 端粒長度，研究結(jié)果顯示：肺癌組外周血RLT明顯短于對照組、職業(yè)暴露組外周血RTL明顯短于肺癌組、對照組，隨著端粒的逐漸縮短，肺癌的危險性增加。再一次證實：外周血端粒長度可作為非小細(xì)胞肺癌的早期效應(yīng)標(biāo)記物。但是，目前端粒長度測定的方法多樣，雖然Q-PCR法可以測定大樣本的端粒長度，但是每個實驗室操作方法欠統(tǒng)一，結(jié)果無法行多中心比較。應(yīng)用端粒長度的測定能否進行肺癌高危人群的篩查及肺癌的早期診斷，還需大樣本的觀察、研究。

端粒長度及端粒酶的活性在腫瘤細(xì)胞及正常體細(xì)胞中的差異，使其可能成為天然有效的抗腫瘤治療靶點[8]。本研究中發(fā)現(xiàn)外周血端粒長度在肺癌組較對照組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。年齡大于60歲人群端粒長度較小于60歲人群端?？s短，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明在肺癌、高齡患者中端?？s短表現(xiàn)更突出，靶點更明確。其次，本研究中發(fā)現(xiàn)端粒長度與腫瘤原發(fā)灶大?。═）呈負(fù)相關(guān)，原發(fā)灶越大，端?？s短越明顯，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況（M）均不相關(guān)，臨床分期越晚，端?？s短越明顯，而我們知道NSCLC臨床分期越晚，預(yù)后越差，本研究也發(fā)現(xiàn)臨床分期越晚，端粒長度越短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由此可以推斷端粒長度在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中呈動態(tài)變化，在腫瘤發(fā)生前期由于端粒逐漸縮短，從而誘導(dǎo)基因突變、重組等分子事件的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[9]；腫瘤發(fā)生后，由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，端粒酶逐漸被激活，維持端粒在一個相對穩(wěn)定的長度。隨著腫瘤的逐漸進展，打破了端粒相對穩(wěn)定的長度，端粒長度繼續(xù)進行性縮短。如何使端粒維持在一個相對穩(wěn)定的長度以及端粒的相對穩(wěn)定長度范圍是多少，是我們將來面臨的難題[10]。由于端粒、端粒酶與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，端粒長度的測定或端粒酶活性過度表達可能成為NSCLC治療的新靶點。通過有效機制延長端粒長度或增加機體端粒酶的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，破壞腫瘤細(xì)胞的無序性生長，為腫瘤的治療提供新的途徑[11]。

Ki-67是一種應(yīng)用廣泛的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物，它出現(xiàn)于細(xì)胞有絲分裂周期的G1后期、S、G2、M期，可以間接代表腫瘤細(xì)胞的增殖活性，反映腫瘤的惡性程度[12-13]。有研究報道Ki-67與腫瘤細(xì)胞的生長速度、患者的預(yù)后密切相關(guān)[14]。Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)高表達提示腫瘤增殖迅速，患者預(yù)后不良，生存時間較短，它可作為判斷肺癌生存期的一個獨立的指標(biāo)[15]。本研究中將Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)與端粒長度進行相關(guān)性的分析發(fā)現(xiàn)，隨著Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)比率逐漸升高，端粒長度逐漸縮短，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，我們猜測端粒的長度可能與NSCLC的惡性程度、預(yù)后、生存期相關(guān)。

由于端粒長度與NSCLC患者的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)，通過對端粒長度的檢測判斷患者的預(yù)后，對于晚期、術(shù)后或放化療后易復(fù)發(fā)的NSCLC患者，可以通過輔助放化療來提高無進展生存期及總生存期，提高生活質(zhì)量，減少死亡率。通過對端粒長度的動態(tài)監(jiān)測，可以將傳統(tǒng)方法（包括手術(shù)、放化療等）治療后患者分為易復(fù)發(fā)組和不易復(fù)發(fā)組，對易復(fù)發(fā)的高?；颊呒皶r給予放化療，減少復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移機率，提高疾病無進展生存期及總生存期；而對于不易復(fù)發(fā)患者，則不采用輔助放化療，從而減少放化療帶來的毒副反應(yīng)，也可以減少治療費用，節(jié)約醫(yī)療成本，實現(xiàn)個體化精準(zhǔn)治療模式。但是，目前針對端粒長度與NSCLC預(yù)后風(fēng)險的相關(guān)性報道較少，且NSCLC的預(yù)后與患者體質(zhì)、免疫力、治療的方式等多種因素相關(guān)，端粒長度與NSCLC的預(yù)后是否相關(guān)，還需要多中心、大樣本的研究、隨訪。本研究因研究時間短，暫未對該組患者進行生存期隨訪及預(yù)后分析。

近年來，已有大量研究表明端粒長度與腫瘤、衰老、心血管、老年癡呆及遺傳等相關(guān)性疾病密切相關(guān)，端粒長度及端粒酶備受關(guān)注，它可能將作為一種潛在的新型腫瘤標(biāo)志物或分子治療靶點。但是，端粒長度檢測技術(shù)復(fù)雜、多樣，目前雖已發(fā)現(xiàn)可通過外周血提取DNA，應(yīng)用Q-PCR法行大樣本人群的檢測，但各個實驗室檢測標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，檢測結(jié)果相差較大，難以進行橫向多中心的比較[14]；其次，由于端粒長度受到機體氧化應(yīng)激、基礎(chǔ)疾病、吸煙史、年齡以及外界環(huán)境刺激等多種因素的影響，如何排除這些因素后，進行端粒長度的變化與腫瘤的相關(guān)性分析，還需要更加深入研究與探索[16]。所以，將端粒長度與端粒酶應(yīng)用于腫瘤篩查、治療、預(yù)后分析等方面，可能還需要很長時間。相信在不久的將來，隨著端粒檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，人們對腫瘤發(fā)病機制的逐漸深入了解，端粒長度或端粒酶或許可能成為非小細(xì)胞肺癌治療的新靶點或新型腫瘤標(biāo)記物，為腫瘤高危人群的篩查、腫瘤治療及預(yù)后預(yù)測提供更好的依據(jù)。