羅偉 甘西 朱佳杰 敖秋桅 譚蕓 陳明 羅永巨

摘要：【目的】確定無(wú)乳鏈球菌侵染吉富品系尼羅羅非魚的途徑及靶器官，為羅非魚抗病育種及無(wú)乳鏈球菌病疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)?！痉椒ā糠謩e采用腹腔注射、經(jīng)口灌胃及體外浸泡3種方式對(duì)吉富品系尼羅羅非魚進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌感染，然后采集感染羅非魚的鰓、脾臟、肝臟和小腸組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，并利用家兔抗無(wú)乳鏈球菌血清進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位，明確不同感染途徑下無(wú)乳鏈球菌在魚體內(nèi)各組織中的分布規(guī)律及其浸染的靶器官?！窘Y(jié)果】3種人工感染方式均能促使吉富品系尼羅羅非魚感染無(wú)乳鏈球菌，其中，腹腔注射和經(jīng)口灌胃在感染2 h后即出現(xiàn)病理變化，而體外浸泡感染方式出現(xiàn)病理變化的時(shí)間約在感染5 h后，且病變程度較腹腔注射和經(jīng)口灌胃的感染方式輕。免疫組織化學(xué)定位發(fā)現(xiàn)，腹腔注射組吉富品系尼羅羅非魚的病原菌信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)槠⑴K→肝臟和鰓→小腸，經(jīng)口灌胃組的病原菌信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)樾∧c→鰓和脾臟→肝臟，體外浸泡組的病原菌信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)轹w→脾臟→肝臟和小腸。【結(jié)論】采用腹腔注射、經(jīng)口灌胃及體外浸泡3種方式均能促使吉富品系尼羅羅非魚感染無(wú)乳鏈球菌，其對(duì)應(yīng)的病原菌信號(hào)分別優(yōu)先在脾臟、腸道和鰓組織出現(xiàn)。因此，自然養(yǎng)殖條件下防止養(yǎng)殖水體和食源被無(wú)乳鏈球菌污染是防控羅非魚無(wú)乳鏈球菌病暴發(fā)的有效措施。

關(guān)鍵詞： 吉富品系尼羅羅非魚；無(wú)乳鏈球菌；致病途徑；靶器官；免疫組織化學(xué)

中圖分類號(hào)： S941.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）02-0375-08

0 引言

【研究意義】無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是廣泛存在于自然界中的條件致病菌，可危害水產(chǎn)養(yǎng)殖中的不同魚類品種，包括羅非魚（Oreochromis niloticus）、卵形鯧鯵（Trachinotus ovatus）、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietalurus punetaus）、石斑魚（Epinephelus sp.）等（Jafar et al.，2008；Amal et al.，2012；劉溪等，2015；郭長(zhǎng)明等，2017；張德鋒等，2017）。自2009年以來(lái)，隨著羅非魚規(guī)模化養(yǎng)殖模式的大面積推廣，其病害日趨嚴(yán)重，尤其是無(wú)乳鏈球菌病危害呈逐漸遞增趨勢(shì)。該病死亡率高，傳播速度快，但至今尚未找到完全根治的方法。因此，亟待開(kāi)展羅非魚抗病品系選育研究以保障其產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，而開(kāi)展羅非魚抗無(wú)乳鏈球菌病育種的前提必須明確羅非魚對(duì)無(wú)乳鏈球菌侵染的免疫應(yīng)答機(jī)制。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)病原菌感染魚類的免疫應(yīng)答機(jī)制研究已有報(bào)道。Skirpstunas和Baldwin（2002）研究發(fā)現(xiàn)，愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）通過(guò)腸道上皮細(xì)胞侵入斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)，從而引起腸道敗血癥；Co-tter等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）最先感染羅非魚的胃腸組織，隨后通過(guò)局部擴(kuò)散作用進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，最后進(jìn)入神經(jīng)中樞系統(tǒng)而引發(fā)腦膜炎等癥狀；Tu等（2010）研究證實(shí)，嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）通過(guò)腸道感染鯉魚（Cyprinus carpio），且感染5周后還能從其腸道中分離出病原菌；但郭松林等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌感染歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）時(shí)最先出現(xiàn)在腎臟組織，隨后通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散至全身而引發(fā)病癥；張永華（2012）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染斑馬魚（Danio rerio）前后IL-1β、IFN和TNF的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，3種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平與感染方式密切相關(guān)，但隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)；Peatmana等（2013）研究證實(shí)，柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）感染斑點(diǎn)叉尾鮰的第一靶器官是鰓組織；季策（2017）研究表明，Notch1a在Notch信號(hào)通路中可能通過(guò)抑制irak家族及NFκB家族基因而抑制TLR通路傳導(dǎo)，在副溶血弧菌感染斑馬魚2 h時(shí)負(fù)向調(diào)節(jié)nfkbiaa、cxcl18b、cxcr3、il11r、c3a、cfb、myhb、myh11a、serpinf2a、ctss2和ctslb等基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控斑馬魚的天然免疫應(yīng)答機(jī)制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國(guó)內(nèi)有關(guān)羅非魚無(wú)乳鏈球菌病的研究主要集中在病原菌分離鑒定（柯劍等，2010；郭玉娟等，2012）、毒力因子篩選（鄧永強(qiáng)和汪開(kāi)毓，2016；方偉等，2016）、藥物防治（華亞南等，2016；梁志凌等，2016）及疫苗研發(fā)（李莉萍等，2015；王瑞等，2015）等方面，而針對(duì)其致病途徑及感染后羅非魚機(jī)體內(nèi)組織的病理學(xué)研究報(bào)道甚少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)腹腔注射、經(jīng)口灌胃和體外浸泡3種方式對(duì)吉富品系尼羅羅非魚進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌感染，然后采集感染羅非魚的鰓、腸、脾臟和肝臟組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，并利用家兔抗無(wú)乳鏈球菌血清進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位，明確不同感染途徑下無(wú)乳鏈球菌在魚體內(nèi)各組織中的分布規(guī)律及其侵染的靶器官，為吉富品系尼羅羅非魚抗病育種及無(wú)乳鏈球菌病疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試吉富品系尼羅羅非魚取自廣西南寧國(guó)家級(jí)羅非魚良種場(chǎng)，SPF級(jí)成年兔購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無(wú)乳鏈球菌株（HN016）由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院魚病防治研究室保存提供。HN016菌株解凍后直接接種于雞血培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，長(zhǎng)出菌落后隨機(jī)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，檢測(cè)其是否攜帶雜菌；然后挑取單個(gè)菌落接種至200 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，搖床上32 ℃培養(yǎng)24 h，以無(wú)菌生理鹽水稀釋至1×107 CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 無(wú)乳鏈球菌感染方式

分別采用腹腔注射、經(jīng)口灌胃和體外浸泡3種方式對(duì)吉富品系尼羅羅非魚進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌感染，感染試驗(yàn)魚置于3 m3的水體大桶中養(yǎng)殖，水溫控制在30～31 ℃，每天投喂膨化餌料2次，每隔3 d換水1次（1/2）。感染后每隔1 h觀察統(tǒng)計(jì)1次羅非魚的發(fā)病或死亡情況，并及時(shí)撈出病魚、死魚。

1. 3 病理形態(tài)學(xué)觀察

采集無(wú)乳鏈球菌感染羅非魚的肝臟、脾臟、鰓和小腸等組織，以Bouins液進(jìn)行固定，經(jīng)梯度脫水、石蠟包埋切片和HE染色后（王晶等，2011），于顯微鏡下觀察不同組織的病理變化。

1. 4 無(wú)乳鏈球菌免疫組化兔一抗血清制備

經(jīng)復(fù)壯培養(yǎng)的HN016菌液用0.08%甲醛在28 ℃振蕩器（300 r/min）上滅活過(guò)夜，以PBS將其濃度調(diào)至5×108 CFU/mL，與弗氏完全佐劑按1∶1混勻，即獲得無(wú)乳鏈球菌HN016免疫原混合液。然后選取5只SPF級(jí)成年兔，在其背部皮下分點(diǎn)注射無(wú)乳鏈球菌HN016免疫原混合液（2.0 mL/只），保證每點(diǎn)注射量0.1～0.2 mL。第1次免疫后，每隔3周加強(qiáng)免疫1次，其方法與第1次免疫相同，共免疫3次。免疫期間提供充足的飼料和水源。3次免疫結(jié)束后，于兔耳中動(dòng)脈采血，血樣先傾斜置于37 ℃培養(yǎng)箱中保存一段時(shí)間（不超過(guò)1 h），再置于4 ℃冰箱過(guò)夜處理，然后在4 ℃下3500 r/min離心30 min，其上層血清即為免疫組化兔一抗血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 免疫組織化學(xué)觀察

包埋好的組織切片經(jīng)脫蠟、水化后進(jìn)行抗原修改，采用三步法DAB顯色（夏永娟等，2000；郭松林等，2011），經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后于顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，采用腹腔注射、經(jīng)口灌胃和體外浸泡3種感染方式均可使無(wú)乳鏈球菌侵入吉富品系尼羅羅非魚體內(nèi)。其中，腹腔注射和經(jīng)口灌胃組的羅非魚在感染2 h后即出現(xiàn)病變，而體外浸泡感染方式出現(xiàn)病變的時(shí)間約在感染5 h后，且病變程度較腹腔注射和經(jīng)口灌胃的感染方式輕。人工感染無(wú)乳鏈球菌后不同時(shí)間的吉富品系尼羅羅非魚鰓、脾臟、肝臟及小腸組織病理變化如下：

鰓：腹腔注射組和經(jīng)口灌胃組的吉富品系尼羅羅非魚在感染2 h后，其鰓組織均已出現(xiàn)明顯病理變化（圖1-A和圖1-B），主要表現(xiàn)為基部上皮細(xì)胞增生，黏液細(xì)胞分泌亢奮，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分鰓小片增粗，其呼吸上皮細(xì)胞和柱狀支持細(xì)胞壞死、崩解，基部與鰓軟骨呈水腫性離散；感染5 h后，腹腔注射組和經(jīng)口灌胃組均有羅非魚表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，此時(shí)鰓組織病理變化十分嚴(yán)重，其基部上皮細(xì)胞大量增生，填滿鰓小片間的間隙，大部分鰓小片的呼吸上皮細(xì)胞和柱狀支持細(xì)胞壞死、崩解，黏液細(xì)胞分泌亢奮，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1-C和圖1-D）。體外浸泡組的吉富品系尼羅羅非魚在感染5 h后鰓組織才出現(xiàn)明顯病理變化（圖1-E和圖1-F），表現(xiàn)為部分鰓小片呼吸上皮細(xì)胞和柱狀支持細(xì)胞壞死、崩解，其基部與鰓軟骨呈水腫性離散，上皮細(xì)胞大量增生，填滿鰓小片間的間隙，鰓小片增粗。

脾臟：腹腔注射組和經(jīng)口灌胃組吉富品系尼羅羅非魚的脾臟在感染2 h后即開(kāi)始出現(xiàn)病理變化，表現(xiàn)為含鐵血黃素增多，巨噬細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)，血管變細(xì)；感染5 h后脾小結(jié)增多變粗，大量細(xì)胞呈空泡變性，胞核溶解消失，脾臟內(nèi)血管變窄或消失，血細(xì)胞下降（圖2-A和圖2-B）。體外浸泡組吉富品系尼羅羅非魚的脾臟在感染5 h后才出現(xiàn)輕微病理變化，至感染8 h時(shí)病變加重，表現(xiàn)為含鐵血黃素大量沉積，血管變窄變細(xì)，巨噬細(xì)胞大量增生且呈彌漫性浸潤(rùn)，中央動(dòng)脈周圍有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2-C）。

肝臟：腹腔注射組吉富品系尼羅羅非魚在感染2 h后，其肝臟呈現(xiàn)明顯病理變化，表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞嚴(yán)重變形或壞死，肝細(xì)胞排列紊亂、胞核消失，甚至出現(xiàn)大面積的壞死灶（圖3-A）。經(jīng)口灌胃組吉富品系尼羅羅非魚的肝臟在感染5 h后才出現(xiàn)明顯病理變化，毛細(xì)血管明顯充血，干細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性或壞死，部分肝細(xì)胞的胞漿和胞核淡染，或溶解消失，僅剩下細(xì)胞輪廓，有的匯集形成明顯的壞死灶（圖3-B）。體外浸泡組吉富品系尼羅羅非魚感染5 h后，其肝臟組織開(kāi)始出現(xiàn)空泡變性，毛細(xì)血管充血破裂；感染8 h后肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡，胞漿、胞核淡染（圖3-C），部分區(qū)域空泡現(xiàn)象嚴(yán)重，且肝右葉空泡明顯多于左葉，但整體的病變程度明顯輕于同時(shí)期的腹腔注射組和經(jīng)口灌胃組。

小腸：腹腔注射組和經(jīng)口灌胃組吉富品系尼羅羅非魚在感染2 h后，其小腸組織出現(xiàn)明顯病理變化，表現(xiàn)為腸絨毛斷裂，腸腔內(nèi)有脫落的上表皮細(xì)胞和均質(zhì)紅染的蛋白滲出物，杯狀細(xì)胞腫大，黏膜下層部分細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)溶解消失；感染5 h后上皮細(xì)胞大面積脫落，紋狀緣消失，吸收細(xì)胞的胞膜溶解消失，肌層平滑肌纖維斷裂，染色不均，或發(fā)生凝固性壞死，固有層與黏膜下層間的間質(zhì)增寬，呈輕度水腫，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4-A和圖4-B）。體外浸泡組吉富品系尼羅羅非魚的小腸組織在感染8 h后出現(xiàn)少量腸絨毛斷裂現(xiàn)象（圖4-C），至感染12 h時(shí)病理變化開(kāi)始加重，腸腔內(nèi)有脫落的上表皮細(xì)胞和均質(zhì)紅染的蛋白滲出物，杯狀細(xì)胞腫大，黏膜下層部分細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)溶解消失，肌層纖維斷裂（圖4-D）。

2. 2 免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果

免疫組織化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，吉富品系尼羅羅非魚鰓組織的病原菌陽(yáng)性信號(hào)主要出現(xiàn)在鰓小片和基部上皮細(xì)胞及周邊的毛細(xì)血管內(nèi)（圖5-A和圖5-B）。脾臟的早期陽(yáng)性信號(hào)主要出現(xiàn)在吞噬了無(wú)乳鏈球菌的吞噬細(xì)胞及其破裂壞死后的周邊區(qū)域；隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，在脾動(dòng)脈血管及水腫病變的血管壁上也能觀察到明顯的陽(yáng)性信號(hào)（圖5-C和圖5-D）；脾臟白髓區(qū)出現(xiàn)較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明迅速增殖的無(wú)乳鏈球菌已引發(fā)靶器官組織發(fā)生病理變化。肝臟陽(yáng)性信號(hào)主要集中在肝血竇內(nèi)及部分吞噬細(xì)胞破裂后的周邊區(qū)域，少量陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)在病變壞死肝血竇周邊的肝細(xì)胞和竇壁細(xì)胞內(nèi)（圖5-E和圖5-F）。在腸道的結(jié)締組織、漿膜層及黏膜下層均能檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)（圖5-G和圖5-H），部分固有膜中也存在陽(yáng)性信號(hào)；除此之外，陽(yáng)性信號(hào)主要集中在含有吞噬細(xì)胞的毛細(xì)血管內(nèi)。

無(wú)乳鏈球菌經(jīng)腹腔注射、經(jīng)口灌胃和體外浸泡3種方式感染吉富品系尼羅羅非魚后，其在試驗(yàn)羅非魚鰓、脾臟、肝臟及小腸組織中的動(dòng)態(tài)定位分布情況見(jiàn)表1。由表1可知，腹腔注射組和經(jīng)口灌胃組吉富品系尼羅羅非魚的4個(gè)組織器官在感染2 h后均能檢測(cè)到病原菌陽(yáng)性信號(hào)，其中，腹腔注射組以脾臟的陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)，經(jīng)口灌胃組以小腸組織的陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)。體外浸泡組吉富品系尼羅羅非魚在感染5 h后僅在鰓組織和脾臟中檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，且以鰓組織的陽(yáng)性信號(hào)較強(qiáng)。根據(jù)病原菌陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)的時(shí)間順序及其強(qiáng)弱分析可知，腹腔注射組吉富品系尼羅羅非魚的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)槠⑴K→肝臟和鰓→小腸，經(jīng)口灌胃組的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)樾∧c→鰓和脾臟→肝臟，體外浸泡組的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)轹w→脾臟→肝臟和小腸。

3 討論

3. 1 吉富品系尼羅羅非魚感染無(wú)乳鏈球菌后機(jī)體組織器官的病理變化特征

無(wú)乳鏈球菌是羅非魚養(yǎng)殖過(guò)程中的主要致病菌，具有傳染快、致死率高、治療困難等特點(diǎn)，但目前尚未明確無(wú)乳鏈球菌是通過(guò)何種途徑從哪個(gè)靶器官侵入羅非魚體內(nèi)。本研究采用腹腔注射、經(jīng)口灌胃和體外浸泡3種方式對(duì)吉富品系尼羅羅非魚進(jìn)行人工感染無(wú)乳鏈球菌，通過(guò)觀察鰓、脾臟、肝臟和小腸組織的病理變化，發(fā)現(xiàn)感染無(wú)乳鏈球菌的吉富品系尼羅羅非魚全身組織器官呈廣泛性充血和出血。鰓作為魚體血液內(nèi)循環(huán)與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換的主要場(chǎng)所（黃錦爐，2012），其病理變化主要是鰓小片上皮和基部細(xì)胞大量增生，且伴有變性甚至壞死脫落，大部分鰓小片增粗并黏連成棒狀，阻礙其攜氧能力，造成魚體血液內(nèi)循環(huán)氧氣利用效率嚴(yán)重減弱甚至喪失，引發(fā)全身組織器官出現(xiàn)缺氧性的功能紊亂，進(jìn)而加速病魚死亡（Azad et al.，2012）。吉富品系尼羅羅非魚感染無(wú)乳鏈球菌后，其脾臟腫大出血，且有大量含鐵血黃素沉積，表明脾臟血管內(nèi)的大量紅細(xì)胞已遭到破壞（Chen et al.，2007；祝璟琳等，2014a），溶血現(xiàn)象嚴(yán)重，其造血功能受阻；同時(shí)魚體的免疫抵抗力降低，進(jìn)而加速病原菌在魚體內(nèi)的增殖。肝臟是魚類的重要消化器官，在蛋白合成、機(jī)體血糖平衡維持和脂肪代謝調(diào)控方面發(fā)揮積極作用，還具有解毒和防御功能（祝璟琳等，2014b）。本研究發(fā)現(xiàn)感染無(wú)乳鏈球菌后的吉富品系尼羅羅非魚肝細(xì)胞變性壞死、排列紊亂，說(shuō)明肝臟代謝功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致機(jī)體能量供應(yīng)不足，進(jìn)而影響其免疫機(jī)能。腸道是魚類消化系統(tǒng)的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn)感染無(wú)乳鏈球菌后的吉富品系尼羅羅非魚小腸內(nèi)容物已排空，腸道內(nèi)大量積水，病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)大部分上皮細(xì)胞變性壞死，說(shuō)明魚體的消化吸收功能受損，導(dǎo)致其攝食能力降低，嚴(yán)重者甚至停止進(jìn)食，從而導(dǎo)致機(jī)體能量供應(yīng)不足。

3. 2 無(wú)乳鏈球菌在感染吉富品系尼羅羅非魚機(jī)體組織中的動(dòng)態(tài)分布情況

目前，已有采用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究病原菌侵入機(jī)體后在各組織器官分布規(guī)律的文獻(xiàn)報(bào)道。夏永娟等（2000）利用免疫組織化學(xué)ABC法對(duì)鰻弧菌人工感染后的牙鲆肝臟和胃腸道組織進(jìn)行致病菌定位研究；郭松林等（2011）利用免疫組織化學(xué)定位技術(shù)對(duì)感染后不同階段嗜水氣單胞菌在歐洲鰻鱺肝臟、腎臟和腸道內(nèi)的分布規(guī)律進(jìn)行研究。本研究利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)吉富品系尼羅羅非魚感染無(wú)乳鏈球菌后不同時(shí)間點(diǎn)的鰓、肝臟、脾臟及小腸組織進(jìn)行病原菌信號(hào)檢測(cè)，并根據(jù)其陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)的時(shí)間順序及其強(qiáng)弱分析3種感染方式的侵襲過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射組吉富品系尼羅羅非魚的病原菌信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)槠⑴K→肝臟和鰓→小腸，經(jīng)口灌胃組的病原菌信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)樾∧c→鰓和脾臟→肝臟，體外浸泡組的病原菌信號(hào)出現(xiàn)順序?yàn)轹w→脾臟→肝臟和小腸。此外，本研究的預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以高濃度的無(wú)乳鏈球菌體外浸泡感染吉富品系尼羅羅非魚，其病原菌雖然可以侵入羅非魚機(jī)體內(nèi)，但并未表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀和死亡現(xiàn)象。由此推測(cè)，自然養(yǎng)殖條件下羅非魚感染無(wú)乳鏈球菌的最先靶器官是鰓組織，但其致病途徑主要是攝食了攜帶有無(wú)乳鏈球菌的食物。

4 結(jié)論

采用腹腔注射、經(jīng)口灌胃和體外浸泡3種方式均能促使吉富品系尼羅羅非魚感染無(wú)乳鏈球菌，其對(duì)應(yīng)的病原菌信號(hào)分別優(yōu)先在脾臟、腸道和鰓組織出現(xiàn)。因此，自然養(yǎng)殖條件下防止養(yǎng)殖水體和食源被無(wú)乳鏈球菌污染是防控羅非魚無(wú)乳鏈球菌病暴發(fā)的有效措施。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）