李潔 王建福

摘要：利用生物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，對牦牛金屬硫蛋白3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而預(yù)測 MT-3 基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)以及功能結(jié)構(gòu)域，并構(gòu)建MT-3同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，牦牛MT-3 基因含有1 個 513 bp 的ORF，編碼 170 個氨基酸。MT-3蛋白分子質(zhì)量約為17 556.37 Da，理論等電點為 5.68。MT-3 編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)主要以β折疊和無規(guī)則卷曲為主，推測是非酶類蛋白質(zhì)。MT-3具有神經(jīng)生長抑制活性，通過清除自由基和 NO ，從而起到保護(hù)腦細(xì)胞的作用。

關(guān)鍵詞：牦牛；金屬硫蛋白3基因；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S826；Q57 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）02-0058-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.02.016

Bioinformatics Analysis of Wild Yak MT-3 Gene

LI Jie， WANG Jianfu

（College of Animal Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：This study aimed to study the bio-information of Wild yak MT-3 gene. The physicochemical characteristics， structures and functions of ovine MT-3 are predicted with software tools and database. Meanwhile， the phylogenetic tree of MT-3 and related proteins is constructed， The results show that the ORF of MT-3 is 513 bp which encoded 170 amino acids. The Wild yak protein of MT-3 is 17 556.37 Da in molecular weight， isoelectric point is 5.68. The secondary structure of MT-3 shows that it is mainly constituted of β-pleated sheet and coils， the encoding production conjecturally belongs to non-enzyme protein. MT-3 has an inhibitory activity on nerve growth， by scavenging free radicals and NO， it plays a role in protecting brain cells.

Key words：Wild yak；Metallothionein 3 gene；Bioinformatics analysis

收稿日期：2017 - 09 - 28

基金項目：甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)子課題（GNSW-2011-27）。

作者簡介：李 潔（1982 — ），女，河南商丘人，實驗師，主要從事動物遺傳育種與繁殖工作。聯(lián)系電話：（0931）7631225。E-mail：lijie@gsau.edu.cn。

通信作者：王建福（1982 — ）男，河南商丘人，講師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖工作。聯(lián)系電話：（0931）7631225。E-mail：wangjf@gsau.edu.cn。

定西市安定區(qū)位于甘肅省中部，北緯35° 17′54″至36° 02′ 40″，東經(jīng)104° 12′ 48″至105° 01′06″，南北長82.9 km，東西寬73.3 km，海拔 1 700～2 580 m，屬典型的黃土高原干旱半干旱雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，抗旱生產(chǎn)是安定區(qū)農(nóng)業(yè)工作的重點。中晚熟玉米適宜海拔在2 000 m以下的區(qū)域種 植[1 ]，而安定區(qū)大面積耕地海拔在2 000 m以上，中晚熟品種很難成熟，全膜雙壟溝播技術(shù)將玉米種植范圍擴(kuò)大到海拔2 100 m區(qū)域[2 - 3 ]。為了考察早熟玉米新品種在安定區(qū)高海拔區(qū)的適應(yīng)性、抗逆性、生產(chǎn)穩(wěn)定性，2017年安定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心引進(jìn)了7個早熟玉米新品種進(jìn)行比較試驗，以期篩選出適合當(dāng)?shù)睾０? 100 m以上區(qū)域生產(chǎn)應(yīng)用的玉米品種?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試玉米品種7個，其中武科早303、武科早304由武威市武科種業(yè)科技有限公司生產(chǎn)，甘玉804由甘肅種業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，興達(dá)1601、興達(dá)1602由甘肅興達(dá)種業(yè)有限公司生產(chǎn)，金穗606、金穗607及當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)種植品種金穗3號（CK）由白銀金穗種業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗地概況

試驗設(shè)在定西市安定區(qū)團(tuán)結(jié)鎮(zhèn)小山村，海拔 2 150 m，年平均降水量430 mm，年蒸發(fā)量1 450 mm，無霜期141 d。前茬作物收獲后深耕曬垡，冬前淺耕耙耱。采用全膜雙壟溝播技術(shù)[4 ]，大壟寬70 cm、高10 cm，小壟寬40 cm、高15 cm。覆膜前結(jié)合整地一次性基施農(nóng)家肥45 000 kg/hm2、玉米專用肥（N-P2O5-K2O為20-15-15）1 200 kg/hm2。用50%辛硫磷乳油7.5 kg/hm2加適量水噴拌細(xì)土450 kg制成毒土，撒施地面后起壟覆膜以防治地下害蟲。用50%乙草胺乳油3 750 mL/hm2兌水600 kg噴灑于壟溝表面芽前除草。

1.3 試驗方法

試驗為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每品種為1個處理，3次重復(fù)，小區(qū)面積39.6 m2（11.0 m×3.6 m）。4月19日用玉米點播器播種，每穴2粒，播深4 cm，行距55 cm，株距30 cm，密度為60 000株/hm2。田間管理措施同當(dāng)?shù)卮筇?。田間觀察記載物候期及主要農(nóng)藝性狀，成熟后按小區(qū)抽樣考種并單收計產(chǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生育期

從表1可以看出，各品種出苗期一致，均在5月2日。金穗607、武科早303、甘玉804、武科早304于6月中旬開始拔節(jié)，與金穗3號（CK）基本一致；興達(dá)1601、金穗606、興達(dá)1602拔節(jié)期較金穗3號（CK）遲13～16 d。抽雄期武科早303、武科早304均為 7月11日，較金穗3號（CK）早4 d；興達(dá)1602與金穗3號（CK）一致；金穗606、興達(dá)1601、甘玉804較金穗3號（CK）晚2 d。成熟期武科早303、武科早304、興達(dá)1602最早，8月下旬已經(jīng)成熟，較金穗3號（CK）早9 d；金穗607、甘玉804、興達(dá)1601、金穗606均在9月上旬與金穗3號（CK）同期成熟。生育期武科早303、武科早304、興達(dá)1602均為117 d，較金穗3號（CK）短9 d；其他品種生育期為126 d，與金穗3號（CK）相同。

2 主要性狀

由表2可見，株高以金穗607、甘玉804、興達(dá)1601最高，均為 2.5 m，較金穗3號（CK）高出0.5 m；武科早304、金穗606次之，均為2.4 m，較金穗3號（CK）高出0.4 m；武科早303、興達(dá)1602最低，為1.7 m，較金穗3號（CK）低0.3 cm。穗位以甘玉804、金穗606最高，為80.0 cm，較金穗3號（CK）高12.5 cm；金穗607次之，為73.0 cm，較金穗3號（CK）高5.5 cm；武科早303最低，為36.5 cm，較金穗3號（CK）低31.0 cm。穗長以興達(dá)1601最長，為23.0 cm，較金穗3號（CK）長5.0 cm；其次為甘玉804，為21.5 cm，較金穗3號（CK）長3.5 cm；武科早304最短，為17.5 cm，較金穗3號（CK）短0.5 cm；其他品種較金穗3號（CK）長0.5～2.0 cm。穗粗以金穗606最粗，為15.6 cm，較金穗3號（CK）粗0.1 cm，其他品種較金穗3號（CK）細(xì)0.2～2.3 cm。軸粗以武科早304最粗，為10.8 cm，較金穗3號（CK）粗0.8 cm；其次是金穗606，為10.3 cm，較金穗3號（CK）粗0.3 cm；其他品種較金穗3號（CK）細(xì)0.3～0.7 cm。粒型武科早304、興達(dá)1602與金穗3號（CK）一致，均為半馬齒型，其余品種均為馬齒型。粒色除武科早303、武科早304為黃紅色外，其余品種均與金穗3號（CK）一致，為黃色。軸色金穗607、甘玉804、興達(dá)1602為淺粉色；武科早303、興達(dá)1601、金穗606和金穗3號（CK）均為棕紅色；武科早304為白色。

2.3 產(chǎn)量及構(gòu)成因子

由表3可知，穗粒數(shù)金穗607最多，為630粒，較金穗3號（CK）多132粒；其次是甘玉804，為552粒，較金穗3號（CK）多54粒；其余品種均較金穗3號（CK）少。百粒重以金穗606最高，為31.6 g，較金穗3號（CK）高8.2 g；其次是武科早303，為28.4 g，較金穗3號（CK）高5.0 g；武科早304、興達(dá)1601分別為27.7、24.5 g，較金穗3號（CK）分別高4.3、1.1 g；其余品種均低于金穗3號（CK）。折合產(chǎn)量以武科早304最高，為8 737.4 kg/hm2，較金穗3號（CK）增產(chǎn)1 186.9 kg/hm2，增產(chǎn)率為15.7%；其次是武科早303，為8 611.1 kg/hm2，較金穗3號（CK）增產(chǎn)1 060.6 kg/hm2，增產(chǎn)率14.0%；金穗607居第3位，折合產(chǎn)量8 585.9 kg/hm2，較金穗3號（CK）增產(chǎn)13.7%；金穗606為8 484.9 kg/hm2，較金穗3號（CK）增產(chǎn)12.4%。對產(chǎn)量進(jìn)行新復(fù)極差比較，各品種間產(chǎn)量差異均達(dá)到極顯著水平。

3 小結(jié)

在安定區(qū)海拔2 150 m的旱區(qū)，對引進(jìn)的7個玉米品種進(jìn)行了引種試驗。結(jié)果表明，參試各玉米品種均可在9月中旬前成熟，武科早304、武科早303、金穗607、金穗606等4個品種綜合性狀優(yōu)良。其中武科早304折合產(chǎn)量最高，為8 737.4 kg/hm2，較對照品種金穗3號增產(chǎn)1 186.9 kg/hm2，增產(chǎn)率為15.7%；武科早303折合產(chǎn)量8 611.1 kg/hm2，較對照品種金穗3號增產(chǎn)1 060.6 kg/hm2，增產(chǎn)率14.0%；金穗607折合產(chǎn)量8 585.9 kg/hm2，較對照品種金穗3號增產(chǎn)13.7%；金穗606較對照品種金穗3號增產(chǎn)12.4%。

張雷等人[5 ]認(rèn)為全膜雙壟溝播栽培玉米可在海拔2300 m以內(nèi)的區(qū)域內(nèi)種植。本試驗通過對供試玉米品種的性狀、生育期及產(chǎn)量結(jié)果進(jìn)行綜合分析，建議在安定區(qū)海拔2 100～2 300 m區(qū)域擴(kuò)大武科早304、武科早303、金穗607及金穗606的種植面積，其他品種可在海拔2 100 m以下區(qū)域進(jìn)一步試驗。

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24（2）：8-11.

（本文責(zé)編：陳 偉）

MT-3是一種金屬硫蛋白，又稱神經(jīng)生長抑制因子，其廣泛存在于哺乳動物的各種組織中，但主要表達(dá)于腦組織，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和雄性生殖系統(tǒng)中也有表達(dá)[1 ]。MT-3的N端高度保守，而C端的氨基酸則相對變化較大[2 ]。據(jù)報道，表達(dá)MT-3的細(xì)胞保護(hù)DNA免受ROS破壞的能力更強(qiáng)，能更有效的保護(hù)單鏈DNA免受羥自由基的破壞[3 ]。在γ射線引起的氧化應(yīng)激時，MT-3抑制了8-羥基鳥苷在細(xì)胞中的積累和基因突變，表現(xiàn)出抗癌和神經(jīng)保護(hù)的作用[4 - 5 ]。在含有MT-3 的神經(jīng)元中能夠調(diào)節(jié)兒茶酚胺能 、谷氨酸能及γ-氨基丁酸（GABA）能的神經(jīng)轉(zhuǎn)換。研究表明，MT-3 可拮抗谷氨酸（Glu）對神經(jīng)元的毒性，通過清除生成的 NO，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用[6 ]。目前，MT-3基因的序列在豬、綿羊、山羊、牦牛、獼猴、家鼠、雞、牛、人等動物中均已公布，但其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。我們以從生物基因組數(shù)據(jù)庫調(diào)取了牦牛MT-3基因的序列為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件和網(wǎng)頁對牦牛 MT-3 基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測和分析，以期為深入研究MT-3基因及其編碼蛋白的基本結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

數(shù)據(jù)資料來源于NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫MT-3基因的參考序列登錄號[7 ]，包括牦牛（XM_014 479472.1）、人（NM_005954.3）、家鼠（NM_013603.2）、豬（NM_214056.1）、牛（NM_001113304.2）、綿羊（NM_001009755.1）、雞（NM_001097538.1）、獼猴（XM_001266138.1）8個物種的mRNA序列。

1.2 方法

牦牛MT-3基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）利用NCBI網(wǎng)頁中的ORF Finder程序?qū)ζ鋗RNA序列進(jìn)行識別預(yù)測分析。MT-3 基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)采用 Bioedit 及 DNAStar 分析軟件預(yù)測。亞細(xì)胞定位采用 PSORTⅡ預(yù)測[8 ]。功能域及功能分類采用 Prot Fun 預(yù)測[9 - 10 ]?？缒^(qū)域的預(yù)測采用TMHMM 程序。二級結(jié)構(gòu)采用 Jpred 分析預(yù)測。多序列比對及同源性分析采用 DNAMAN 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛MT-3基因的ORF分析

利用NCBI網(wǎng)頁中的ORF Finder程序?qū)﹃笈T-3基因的mRNA序列進(jìn)行預(yù)測分析的結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，牦牛MT-3基因序列中最大的開放閱讀框長度為513 bp，起始密碼子位于 55 bp 處，終止密碼子位于 567 bp 處，分析有170 個氨基酸殘基構(gòu)成該編碼產(chǎn)物。

2.2 牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物序列同源性分析

利用DNAMAN軟件對牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物序列同源性進(jìn)行分析的結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，MT-3在很多物種中均有表達(dá)，尤其與牛、綿羊MT-3氨基酸序列同源性較高，推測與牛、綿羊這2個物種在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系較近。從牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以看出，牦牛、牛系統(tǒng)發(fā)育距離最近與牛的親緣相似性高達(dá)99%。

2.3 牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括其相對分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點等[11 - 12 ]。采用 Bioedit 及 DNAStar 分析軟件預(yù)測牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成的結(jié)果（圖4）表明， MT-3基因編碼 170個氨基酸，組成最多的氨基酸是 Cys（半胱氨酸），所占比例為 15.3%。其編碼產(chǎn)物的理論分子量約為17 556.37 Da，理論等電點為 5.68。

2.4 牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位分析

從牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位結(jié)果（表1）可知，其分布在細(xì)胞核中的可能性為69.6%，分布在細(xì)胞質(zhì)的可能性為13.0%，分布在線粒體的可能性為 4.3%，分布在細(xì)胞骨架的可能性為 12.9%。由此推斷，牦牛MT-3編碼產(chǎn)物主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.5 牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能預(yù)測與分析

牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能分析采用ProtFun分析軟件進(jìn)行預(yù)測，其結(jié)構(gòu)域是二級蛋白序列片段經(jīng)過盤曲折疊形成的超二級結(jié)構(gòu)，不同的結(jié)構(gòu)域具有不同的特定的功能作用[12 ]。從表2可知，MT-3主要具有調(diào)控功能、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、翻譯和輔酶因子的生物合成的功能，可能性分別為0.265%、0.194%、0.105%和0.051%。由此推斷該蛋白具有調(diào)控功能的可能性最高，另外該蛋白在翻譯、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。

2.6 牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物信號肽預(yù)測與分析

信號肽序列存在于分泌蛋白基因編碼序列中，位于起始密碼子之后的一段富含疏水氨基酸多肽的序列。如圖5所示，預(yù)測牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物不存在信號肽，無跨膜區(qū)，為非分泌性蛋白。

2.7 牦牛MT-3基因編碼產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測與分析

對牦牛MT-3氨基酸序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用在線預(yù)測工具 Jpred分析的結(jié)果（圖 6 ）所知，牦牛MT-3 編碼產(chǎn)物從 N 端的第 13個氨基酸才開始出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，前12個氨基酸均沒有形成二級結(jié)構(gòu)。MT-3蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由5個β折疊和多個無規(guī)則卷曲組成，沒有α螺旋。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，牦牛MT-3 基因 ORF 長度為 513 bp，編碼170個氨基酸殘基；組成最多的氨基酸是 Cys（半胱氨酸），所占比例為 15.3%，其理論分子量約為 17 556.37 Da， 理論等電點為5.68。MT-3在很多物種中都有表達(dá)，其中與綿羊、牛MT-3編碼的氨基酸序列同源性一致，在系統(tǒng)發(fā)育樹中的距離最近。MT-3 編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)主要以β折疊和無規(guī)則卷曲為主。MT -3 除具有神經(jīng)生長抑制活性外，還可通過清除自由基和 NO ，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

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（本文責(zé)編：楊 杰）