方瑜潔　張明麗

西安市第一醫(yī)院干五消化科(710002)

背景：血管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用。AGGF1是一個新發(fā)現(xiàn)的血管生成因子，在多種惡性腫瘤中存在異常表達。目的：探討AGGF1表達與結(jié)腸癌患者預后的關(guān)系。方法：收集西安市第一醫(yī)院2010年1月—2012年12月80例結(jié)腸癌手術(shù)患者的癌組織和配對癌旁組織標本，以免疫組化法檢測AGGF1表達。分析癌組織AGGF1表達與腫瘤臨床病理特征和患者預后的關(guān)系，以Cox回歸模型分析結(jié)腸癌患者的預后影響因素。結(jié)果：結(jié)腸癌組織AGGF1表達陽性率顯著高于癌旁組織(67.5%對32.5%,P<0.05)，并與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤和TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，AGGF1陰性表達結(jié)腸癌患者的生存率顯著高于AGGF1陽性表達患者(P<0.05)。單因素和多因素分析表明，AGGF1與結(jié)腸癌患者預后顯著相關(guān)(OR=2.09, 95% CI: 1.67～4.45, P=0.011; OR=1.98, 95% CI: 1.72～4.59, P=0.000)。結(jié)論：結(jié)腸癌組織中血管生成因子AGGF1表達顯著升高，并與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預后不良相關(guān)，是一個潛在的預后指標，值得進一步深入研究。

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，年新發(fā)病例數(shù)在全球惡性腫瘤中居第三位[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多階段的過程，但是其具體機制尚不清楚。AGGF1(angiogenic factor with G-patch and FHA domains 1)基因于2004年首次被克隆、鑒定[2]，該基因高表達于血管內(nèi)皮細胞，編碼蛋白具有強烈的血管生成作用。研究發(fā)現(xiàn)AGGF1在多種惡性腫瘤中存在異常表達，可能參與了腫瘤演進過程中的多種病理過程，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并與患者預后不良密切相關(guān)[3-6]。本研究通過分析80例結(jié)腸癌患者的AGGF1表達情況及其相關(guān)臨床資料，旨在探討AGGF1表達與結(jié)腸癌患者預后的關(guān)系。

材料與方法

一、一般資料

回顧性收集西安市第一醫(yī)院2010年1月—2012年12月結(jié)腸癌手術(shù)患者80例。入選患者中男性47例，女性33例，年齡37～78歲，平均(57.2±6.3)歲，術(shù)前均未接受放化療以及其他相關(guān)治療；結(jié)腸癌診斷經(jīng)術(shù)后病理檢查證實，手術(shù)標本蠟塊保存于病理科，臨床病理資料和隨訪信息完整。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

二、方法

1. 資料采集：通過查閱住院病史獲取患者臨床病理資料，電話和門診隨訪生存信息，以手術(shù)時間為隨訪起點，截止至2017年12月。

2. AGGF1免疫組化染色：采用免疫組化SP法，主要試劑購自北京諾和生物技術(shù)有限公司。結(jié)腸癌組織和配對癌旁非癌組織病理切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；3% H2O2室溫孵育10 min；檸檬酸鈉緩沖液95 ℃加熱10 min，室溫放置30 min，PBS漂洗；10%羊血清室溫孵育30 min；加入AGGF1抗體，4 ℃過夜；多次沖洗后加入生物素標記的兔二抗，室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。

AGGF1主要表達于細胞質(zhì)，免疫陽性物質(zhì)呈淡黃色至棕褐色。于200倍視野下計數(shù)不少于200個細胞，根據(jù)陽性細胞比例和染色強度進行免疫組化評分。陽性細胞比例：0分，無陽性細胞；1分，陽性細胞<10%；2分，陽性細胞10%～50%；3分，陽性細胞>50%。 染色強度：0分，不著色；1分，淡黃色；2分，棕色；3分，棕褐色?？偡譃閮身椩u分的乘積，≥1分判定為AGGF1表達陽性。由2名病理專科醫(yī)師進行獨立評分，評分不一致時由上級病理學專家確定最終評分。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié)　　果

一、結(jié)腸癌組織AGGF1表達

免疫組化染色顯示，80例結(jié)腸癌組織中54例AGGF1表達陽性，配對癌旁組織中26例AGGF1表達陽性，癌組織AGGF1表達陽性率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(67.5%對32.5%, χ2=19.600,P<0.001)(圖1)。

A：AGGF1陽性表達；B：AGGF1陰性表達

二、AGGF1表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性

統(tǒng)計學分析顯示，結(jié)腸癌組織中的AGGF1表達與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤和TNM分期之間存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，與患者性別、年齡以及腫瘤大小和浸潤深度無明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)(表1)。

三、AGGF1表達陽性與陰性結(jié)腸癌患者生存率比較

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，AGGF1陰性表達結(jié)腸癌患者的生存率明顯高于AGGF1陽性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

四、結(jié)腸癌患者預后影響因素的單因素和多因素分析

Cox回歸模型單因素分析顯示，腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤、TNM分期和AGGF1表達與結(jié)腸癌患者的預后顯著相關(guān)(P<0.05)(表2)；多因素分析中、上述因素亦均與預后顯著相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表1　AGGF1表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

圖2AGGF1表達陽性與陰性結(jié)腸癌患者生存率比較(Kaplan-Meier生存曲線)

表2　結(jié)腸癌患者預后影響因素單因素分析(Cox回歸模型)

表3　結(jié)腸癌患者預后影響因素多因素分析(Cox回歸模型)

討　　論

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移力強，但腫瘤轉(zhuǎn)移的確切機制尚不清楚。血管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用，以腫瘤血管生成為靶點探索新的預后評估指標和新的治療方案具有重要臨床意義。AGGF1是一個新發(fā)現(xiàn)的血管生成因子，參與血管分化，啟動血管生成和血管網(wǎng)絡維護。在斑馬魚胚胎中，AGGF1被證實具有調(diào)控血管生成和分化、參與靜脈建立的作用[7]。對肢體缺血小鼠模型的研究[8]亦表明，AGGF1能促進血管生成、增加血流量、抑制組織壞死。

研究發(fā)現(xiàn)AGGF1在多種惡性腫瘤中表達異常，但關(guān)于其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制尚不完全清楚。本研究檢測了80例結(jié)腸癌組織及其配對癌旁非癌組織中的AGGF1表達情況，發(fā)現(xiàn)癌組織AGGF1表達陽性率顯著高于癌旁組織，與既往在食管鱗癌[3]、肝細胞癌[4-5]、胃癌[6]中的發(fā)現(xiàn)相一致。上述研究還發(fā)現(xiàn)，AGGF1高表達與患者生存率降低顯著相關(guān)，是患者預后不良的獨立危險因素。本研究進一步分析了結(jié)腸癌組織AGGF1表達與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示其表達與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤和TNM分期顯著相關(guān)；Kaplan-Meier生存曲線分析表明AGGF1陰性表達患者的生存率顯著高于AGGF1陽性表達患者；Cox回歸模型單因素和多因素分析表明AGGF1是結(jié)腸癌患者的獨立預后因素。提示AGGF1可能通過參與結(jié)腸癌腫瘤血管生成，參與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。既往研究[3-5]證實，AGGF1表達與腫瘤組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達和微血管密度呈顯著正相關(guān)。關(guān)于AGGF1調(diào)控腫瘤血管生成的分子機制，目前尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在結(jié)腸癌中參與VEGF的表達調(diào)控[9]；而AGGF1作為核染色質(zhì)相關(guān)蛋白，參與了β-catenin介導的結(jié)腸癌細胞基因轉(zhuǎn)錄[10]。因此，通過β-catenin信號通路誘導VEGF表達可能是AGGF1參與調(diào)節(jié)結(jié)腸癌腫瘤血管生成的機制之一。

除參與腫瘤血管生成外，AGGF1表達異常尚可能通過其他機制參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，AGGF1蛋白在高級別尿路上皮癌中的強陽性表達率明顯低于低級別尿路上皮癌和正常尿路上皮組織，可能的原因是低氧在高級別尿路上皮癌中更為常見，AGGF1表達下調(diào)可能通過抑制低氧誘導的腫瘤細胞凋亡，對低氧環(huán)境中的腫瘤細胞發(fā)揮保護作用。其確切作用機制有待進一步深入研究。

綜上所述，血管生成因子AGGF1在結(jié)腸癌組織中的表達顯著升高，并與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預后不良相關(guān)，是一個潛在的預后指標。本研究局限性主要在于樣本量較小以及未評估AGGF1基因表達。后續(xù)研究擬完善上述不足，進一步探討AGGF1參與結(jié)腸癌腫瘤血管生成的確切機制。