甄玲玲　苗　蓓　陳影影　蘇　貞　徐曼秋　費素娟　張建福

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(221002)

背景：小腦頂核(FN)參與對心血管、攝食、呼吸運動、急性胃黏膜損傷等內(nèi)臟活動的調(diào)節(jié)，但對內(nèi)臟高敏感的調(diào)節(jié)作用及其可能的機(jī)制目前尚未完全清楚。目的：探討小腦FN注射谷氨酸(Glu)對慢性內(nèi)臟高敏感大鼠的影響及其可能的機(jī)制。方法：采用新生期大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)法制備慢性內(nèi)臟高敏感模型。8周后，將大鼠分為CRD組、溶劑組(小腦FN注射0.2 μL 0.9% NaCl溶液)、高、中、低劑量Glu組(小腦FN分別注射12、6、3 μg Glu)、3-MPA+Glu組(小腦FN注射谷氨酸脫羧酶抑制劑3-MPA后注射12 μg Glu)、Bic+Glu組(下丘腦外側(cè)區(qū)注射GABAA受體拮抗劑Bic后小腦FN注射12 μg Glu)。以痛閾、腹壁回撤反射(AWR)評分和腹外斜肌放電肌電圖(EMG)幅度評估內(nèi)臟敏感性，檢測丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果：成功制備慢性內(nèi)臟高敏感大鼠模型。與CRD組相比，Glu可劑量依賴性地升高痛閾(P<0.05)，降低AWR評分和EMG幅度(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)，升高SOD活性(P<0.05)。與12 μg Glu組相比，3-MPA+Glu組、Bic+Glu組痛閾顯著降低(P<0.05)，AWR評分和EMG幅度顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：小腦FN注射Glu可明顯降低大鼠內(nèi)臟敏感性，其機(jī)制可能為FN的Glu在谷氨酸脫羧酶作用下生成GABA，與下丘腦外側(cè)區(qū)GABAA受體結(jié)合，增強(qiáng)腸黏膜組織的抗氧化能力，從而降低內(nèi)臟敏感性。

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一種常見的腸道功能性疾病，研究表明，IBS患者占消化科門診患者的25%左右[1]。目前IBS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為內(nèi)臟高敏感在其發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用。研究表明，小腦不僅參與對軀體運動的調(diào)控，還參與調(diào)節(jié)非軀體性活動包括學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知、語言、內(nèi)臟活動等[2-4]。小腦對胃腸道痛覺的調(diào)控作用尚未見報道。本研究通過小腦頂核(FN)注射化學(xué)藥物，旨在探討其對慢性內(nèi)臟高敏感大鼠的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制，從而為研究IBS的發(fā)病機(jī)制提供新的思路和治療途徑。

材料與方法

一、實驗動物

新生Sprague-Dawley(SD)幼鼠34只(親代大鼠購自徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，雌雄不拘，每8只與母鼠同籠飼養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)，至21 d后幼鼠與母鼠分籠，幼鼠每4只一籠，室溫、晝夜節(jié)律條件下飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

二、主要試劑

谷氨酸(Glu)、谷氨酸脫羧酶抑制劑3-MPA、GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿(Bic)均為Sigma公司產(chǎn)品。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

三、研究方法

1. 實驗分組：將新生幼鼠隨機(jī)分為模型組(n=28)和假手術(shù)組(n=6)，模型組幼鼠行結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distension, CRD)。第9周，將模型組大鼠隨機(jī)分為七組，分別為CRD組、溶劑組[小腦FN微量注射0.2 μL 0.9% NaCl溶液(NS)]、Glu組(3、6、12 μg Glu分別溶于0.2 μL NS，小腦FN微量注射)、3-MPA+Glu組(20 μg 3-MPA溶于 0.2 μL NS，小腦FN微量注射，10 min后將12 μg Glu注射至小腦FN內(nèi))、Bic+Glu組[Bic 10 μg溶于 0.2 μL NS，下丘腦外側(cè)區(qū)(LHA)微量注射，10 min后將 12 μg Glu注射至小腦FN內(nèi)]，每組各4只。

2. 慢性內(nèi)臟高敏感大鼠模型的建立

①幼鼠慢性內(nèi)臟高敏感模型的建立：參照Al-Chaer等[5]的方法并作相應(yīng)改進(jìn)來制備CRD大鼠，將出生后第8、10、12天的幼鼠，于上午9時和11時采用棉簽沾濕溫水擦拭肛門兩圈，將直徑 3 mm、長10 mm的經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)球囊從肛門完全插入結(jié)直腸中，然后行充氣擴(kuò)張(壓力為60 mm Hg)(1 mm Hg=0.133 kPa)，持續(xù)1 min后放氣撤出，清潔肛門，放回母鼠身邊。假手術(shù)組幼鼠僅用球囊刺激肛門，不插入直腸。

②成年大鼠CRD球囊的制作：球囊長度為4 cm，由輸液延長管插入6號乳膠手套小指制成，用絲線結(jié)扎導(dǎo)管和指套根部，確保球囊與導(dǎo)管間不漏氣，導(dǎo)管另一端通過三通管，一端連接充氣注射器，另一端連血壓計。球囊制備后充氣，備用。

3. 大鼠內(nèi)臟敏感性的測定：大鼠實驗前18 h禁食不禁水，以10%水合氯醛麻醉。

①痛閾測量：將涂有石蠟油的球囊輕輕插入大鼠肛門內(nèi)5～6 cm，肛門外導(dǎo)管固定于大鼠尾根部。緩慢向球囊注射空氣，初始壓力為10 mm Hg，其后依次遞增10 mm Hg，維持10 s 后，抽出空氣，間隔4 min，再次重復(fù)加壓，直至大鼠AWR評分達(dá)3分，記錄最小的壓力值，實驗重復(fù)5次，取均值。

②腹壁回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評分：按前述方法將球囊插入大鼠肛門并固定，然后放入有機(jī)玻璃觀察箱內(nèi)(20 cm×12 cm×9 cm)，待其蘇醒并完全適應(yīng)環(huán)境30 min后開始實驗。通過注射器向球囊內(nèi)注入空氣，壓力分別為20、40、60、80 mm Hg，每次持續(xù)20 s，間隔4 min，記錄大鼠AWR評分。每個壓力重復(fù)3次，取均值。

AWR評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，大鼠無明顯行為變化；1分，大鼠身體靜止不動或僅有簡單的頭部運動；2分，大鼠腹部肌肉開始收縮，但腹壁未抬離桌面；3分，大鼠腹壁明顯收縮變平或下腹壁抬離桌面；4分，大鼠腹壁拱起或伴身體、骨盆躬起。

③腹外斜肌放電肌電圖(electromyography, EMG)幅度：將涂有石蠟油的球囊插入大鼠結(jié)直腸內(nèi)，切開一側(cè)腹部皮膚，暴露腹外斜肌，插入消毒銀絲雙電極。采用BL-420E生物信號采集處理系統(tǒng)記錄腹外斜肌的基礎(chǔ)放電(高頻濾波2 kHz，時間常數(shù)0.001 s，采樣頻率40 Hz，靈敏度500 mV，走紙速度250 ms/div)，然后CRD壓力迅速達(dá)到20、40、60、80 mm Hg，每次加壓記錄10 s，間隔4 min，記錄各個壓力下腹外斜肌放電幅度。腹外斜肌EMG幅度為每個壓力下腹外斜肌放電的幅度減去基礎(chǔ)放電的幅度。

4. 組織學(xué)檢查：行為學(xué)實驗完畢后處死大鼠，快速取結(jié)直腸段，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，并取部分腸段固定于4%甲醛溶液，石蠟切片，行HE染色。觀察結(jié)直腸局部組織有無損傷、炎癥等病理改變。

5. 核團(tuán)微量注射：實驗前大鼠禁食18 h，自由飲水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，按大鼠腦圖譜，定位小腦FN(坐標(biāo)：AP 11.64 mm, RL 1.20 mm, H 6.50 mm)和LHA(坐標(biāo)：AP 2.12 mm, RL 1.50 mm, H 8.40 mm)[6]。采用微量進(jìn)樣器進(jìn)行注射，10 min內(nèi)注射完畢。退出微量進(jìn)樣器，滴加骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮切口。

注射4 h后檢測各組大鼠痛閾、AWR評分(CRD壓力為40 mm Hg)、EMG幅度(CRD壓力為40 mm Hg)。檢測完畢后，處死大鼠，取出大腦，-80 ℃ 保存，行腦定位鑒定。

6. 腸黏膜MOD含量和SOD活性的測定：將腸組織制成10%的組織勻漿，采用TBA法測定MDA含量(以nmol/100 mg組織干重表示)。取1/4稀釋成1%的組織勻漿，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性(以U/mg蛋白表示)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)　　果

一、慢性內(nèi)臟高敏感大鼠模型的建立

與假手術(shù)組相比，模型組痛閾顯著降低(P<0.01)；擴(kuò)張壓力為20、40、60 mm Hg時，模型組大鼠AWR評分和EMG幅度均顯著增高(P<0.01)，而擴(kuò)張壓力為80 mm Hg時，兩組AWR評分和EMG幅度均無明顯差異(P>0.05)(圖1)。表明新生幼鼠給予CRD，成年后內(nèi)臟敏感性明顯增強(qiáng)。

二、組織形態(tài)學(xué)

HE染色顯示模型組和假手術(shù)組大鼠直腸黏膜均未見明顯病理變化。黏膜下層結(jié)構(gòu)完整，周圍間質(zhì)無明顯水腫、無中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，無纖維結(jié)締組織增生(圖2)。

三、小腦FN注射Glu對大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

*與假手術(shù)組比較，P<0.01

A：模型組；B：假手術(shù)組

圖2模型組和假手術(shù)組大鼠組織形態(tài)學(xué)比較(HE染色，×400)

注射前，CRD組、溶劑組以及3、6、12 μg Glu組痛閾、AWR評分、EMG幅度相比均無明顯差異(P>0.05)。注射后，3、6、12 μg Glu組痛閾較CRD組顯著升高(P<0.05)，AWR評分、EMG幅度顯著降低(P<0.05)。與注射前相比，Glu可呈劑量依賴性地升高痛閾、降低AWR評分和EMG幅度(P<0.05)(圖3)。

四、小腦FN注射3-MPA+Glu對大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

與12 μg Glu組相比，3-MPA+Glu組痛閾顯著降低(P<0.05)，AWR評分和EMG幅度顯著升高(P<0.05)(圖4)。

五、LHA注射Bic對大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

與12 μg Glu組相比，Bic+Glu組痛閾顯著降低(P<0.05)，AWR評分和EMG幅度顯著升高(P<0.05)。Bic+Glu組痛閾、AWR評分、EMG幅度與CRD組相比均無明顯差異(P>0.05)(圖5)。

六、大鼠MDA含量和SOD活性

與CRD組相比，3、6、12 μg Glu組MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)；而3-MPA+Glu組、Bic+Glu組與CRD組相比無明顯差異。與12 μg Glu組相比，3-MPA+Glu組、Bic+Glu組MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)(圖6)。

*與注射前和CRD組比較，P<0.05；#與3 μg Glu組比較，P<0.05；△與6 μg Glu組比較，P<0.05

*與注射前和CRD組比較，P<0.05；#與12 μg Glu組比較，P<0.05

*與注射前和CRD組比較，P<0.05；#與12 μg Glu組比較，P<0.05

*與CRD組比較，P<0.05；#與12 μg Glu組比較，P<0.05

討　　論

IBS的發(fā)病率呈增高趨勢，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中慢性內(nèi)臟高敏感作為IBS的特征性病理生理改變已被廣泛認(rèn)可。

研究表明，哺乳動物腦發(fā)育存在“腦生長發(fā)育突發(fā)期”[7]，大鼠為出生后11 d左右。若在此時受到反復(fù)機(jī)械性或化學(xué)性刺激，容易對大鼠大腦產(chǎn)生永久的結(jié)構(gòu)或功能變化[8]。本實驗參照Al-Chaer等[5]的CRD制備慢性內(nèi)臟高敏感大鼠模型的方法并作相應(yīng)改進(jìn)，選擇在大鼠出生后第8、10和12天，在固定時間給予結(jié)直腸球囊擴(kuò)張刺激1 min，每天2次，共6次。成年后發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠痛閾降低，AWR評分和EMG幅度增高，且所有大鼠結(jié)腸組織未見明顯病理變化。表明有效復(fù)制了IBS樣內(nèi)臟高敏感大鼠模型。

目前認(rèn)為腦-腸軸與IBS的發(fā)病關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦室旁核、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)等核團(tuán)參與了大鼠慢性內(nèi)臟痛的調(diào)節(jié)[9-10]，而近年神經(jīng)解剖學(xué)、行為學(xué)、功能性腦成像研究以及對小腦占位性病變患者的臨床研究進(jìn)一步加深了小腦在非軀體調(diào)節(jié)中作用的認(rèn)識。本課題組以往研究[11-12]通過向小腦FN注射GABAA受體激動劑和拮抗劑，發(fā)現(xiàn)小腦FN通過GABAA受體參與了大鼠急性胃黏膜損傷。本研究中，CRD大鼠小腦FN注射不同劑量Glu，在一定刺激壓力(40 mm Hg)下，可明顯降低大鼠內(nèi)臟敏感性，并呈劑量依賴性。說明FN可能通過Glu參與對慢性內(nèi)臟高敏感的調(diào)節(jié)，起有一定的鎮(zhèn)痛作用。

Glu在腦組織中的含量很高，屬興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA則屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，因其不能透過血腦屏障，故腦組織中的GABA均由Glu經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧而生成。本實驗中，在小腦FN注射Glu前先注射谷氨酸脫羧酶抑制劑3-MPA，可抑制Glu的鎮(zhèn)痛作用。說明Glu并非直接調(diào)控痛覺的敏感性，而是通過谷氨酸脫羧酶生成的GABA來發(fā)揮調(diào)控內(nèi)臟敏感性的作用。

然而迄今小腦參與非軀體性活動的機(jī)制尚未完全闡明。越來越多的證據(jù)表明，小腦-下丘腦之間存在雙向、直接的神經(jīng)纖維投射，即小腦-下丘腦投射(cerebellohypothalamic projection)和下丘腦-小腦投射(hypothalamocerebellar projection)，兩者構(gòu)成了小腦-下丘腦神經(jīng)環(huán)路。小腦-下丘腦的投射纖維起源于小腦的三個深部核團(tuán)(FN、間位核和齒狀核)的神經(jīng)元，經(jīng)小腦上腳上行投射至LHA、背內(nèi)側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)核、室旁核等重要核團(tuán)[13]。近年神經(jīng)解剖學(xué)研究證明了小腦FN神經(jīng)元的軸突主要投射至LHA，進(jìn)一步證明了其投射路徑和部位[14]。推測可能是小腦參與內(nèi)臟活動調(diào)節(jié)的解剖學(xué)基礎(chǔ)。

小腦FN內(nèi)存在大量GABA能神經(jīng)元[15]。資料表明，LHA和室旁核神經(jīng)元胞膜上同時存在GABAA和GABAB受體及其亞型[16-17]。鑒于上述研究，本實驗通過LHA注射GABAA受體拮抗劑Bic后再向小腦FN注射Glu，結(jié)果顯示痛閾、AWR評分、EMG幅度與CRD組均無明顯差異，說明Glu未能發(fā)揮對內(nèi)臟敏感性的調(diào)控作用。由此可見，小腦FN注射Glu后，慢性內(nèi)臟高敏感大鼠敏感性的改善可能是主要由小腦FN的Glu在谷氨酸脫羧酶作用下轉(zhuǎn)化為GABA，然后通過小腦-下丘腦神經(jīng)環(huán)路，與LHA的GABAA受體結(jié)合來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的。

MDA是反映氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的間接指標(biāo)。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，其活性被認(rèn)為是一種評估抗氧化能力直接的指標(biāo)。本實驗中，Glu組SOD活性較CRD組升高、MDA含量降低，表明小腦FN注射Glu可增強(qiáng)結(jié)直腸組織的抗氧化能力和組織抗損傷的效應(yīng)。

綜上所述，小腦FN參與了對大鼠內(nèi)臟痛覺的調(diào)控，注射Glu可明顯減輕大鼠內(nèi)臟敏感性，其機(jī)制可能是通過化學(xué)刺激小腦FN，使FN神經(jīng)元興奮，神經(jīng)元合成和釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA增多，GABA通過小腦-下丘腦神經(jīng)環(huán)路作用于LHA神經(jīng)元胞膜上的GABAA受體，使LHA神經(jīng)元發(fā)生抑制性效應(yīng)，導(dǎo)致下傳神經(jīng)沖動減少，自主神經(jīng)興奮性減低，使腸黏膜細(xì)胞分泌的保護(hù)性物質(zhì)增多，損傷因素減少，增強(qiáng)了腸黏膜組織的抗損傷能力，從而起鎮(zhèn)痛的作用。但結(jié)論仍需行進(jìn)一步研究證實。