孫鑫洲　張林　王士雷　李瑜　張殿隆　高清華

[摘要]目的探討右美托咪定對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞低氧復(fù)氧損傷中線粒體分裂的影響及其機(jī)制。

方法

原代培養(yǎng)出生24 h內(nèi)的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，采用氧糖剝奪法建立低氧復(fù)氧模型，隨機(jī)數(shù)字表法分成8組（n=6）：正常對(duì)照組（C組，不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理）、賦形劑組（V組，不進(jìn)行低氧復(fù)氧處理，加入體積分?jǐn)?shù)0.000 1的二甲亞砜培養(yǎng)6 h）、低氧復(fù)氧組（H/R組，采用氧糖剝奪法低氧6 h、復(fù)氧20 h，建立大鼠海馬神經(jīng)元低氧復(fù)氧損傷模型）、H/R+右美托咪定0.1 μmol/L組（D1組）、H/R+右美托咪定1.0 μmol/L組（D2組）、H/R+右美托咪定5.0 μmol/L組（D3組）、H/R+右美托咪定10.0 μmol/L組（D4組）、H/R+右美托咪定100.0 μmol/L組（D5組），D1、D2、D3、D4、D5組在低氧復(fù)氧期間分別加入終濃度為0.1、1.0、5.0、10.0、100.0 μmol/L的右美托咪定，低氧6 h，復(fù)氧20 h。觀察各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量與形態(tài)，檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞活性、細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子熒光強(qiáng)度以及線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1、Fis1和細(xì)胞色素C（CytC）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的表達(dá)。

結(jié)果與C組比較，H/R組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量和活性明顯降低，鈣離子熒光強(qiáng)度、Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表達(dá)均增高，差異有顯著性（F=221.10～816.00，P<0.05）；V組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與H/R組比較，D1、D2、D3組神經(jīng)元細(xì)胞活性升高，鈣離子熒光強(qiáng)度和Drp1、Fis1、CytC、AIF蛋白表達(dá)顯著降低，其中D2組降低更為明顯，差異有顯著性（F=221.10～816.00，P<0.05）。

結(jié)論右美托咪定能夠減輕低氧復(fù)氧對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，可能通過抑制線粒體分裂發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞]右美托咪定；線粒體；低氧；海馬；神經(jīng)元

[中圖分類號(hào)]R971.3；R614.24

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)] 20965532（2018）02015606

臨床麻醉中常出現(xiàn)心臟停搏、休克、手術(shù)意外等急危重癥情況，易造成大腦缺血/再灌注（I/R）損傷，表現(xiàn)為不同程度的腦功能障礙，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率[1]。對(duì)應(yīng)用麻醉藥物時(shí)的腦保護(hù)研究一直都是臨床麻醉探索的熱點(diǎn)之一。丙泊酚和異氟烷都可以通過不同的機(jī)制減輕大腦I/R損傷[24]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體除作為細(xì)胞供能的細(xì)胞器以外，在細(xì)胞凋亡的過程中同樣起著重要的作用[5]。研究顯示，線粒體處在一個(gè)不斷分裂/融合的平衡狀態(tài)，而這種狀態(tài)的維持與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。I/R損傷可導(dǎo)致線粒體分裂增加，從而加重細(xì)胞凋亡[6]，抑制I/R損傷過程中的線粒體分裂過程，可以有效抑制細(xì)胞凋亡。研究顯示，右美托咪定可以通過抑制鈣離子內(nèi)流減輕腦I/R損傷[7]，但尚無研究探討右美托咪定是否可以通過作用于線粒體分裂來減輕腦I/R損傷。本實(shí)驗(yàn)旨在探討右美托咪定對(duì)腦I/R損傷過程中線粒體分裂的影響。

1材料和方法

1.1海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)

出生24 h之內(nèi)的SD大鼠（由青島市藥檢所動(dòng)物中心提供），用體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇消毒，在冰袋上摘取海馬組織，用2.5 g/L胰酶消化20 min。加入DMEMF12細(xì)胞種植液（美國(guó)Hyclone公司）終止消化20 min，用200目濾網(wǎng)對(duì)海馬細(xì)胞的消化懸液進(jìn)行過濾，然后離心。將獲得的海馬神經(jīng)元細(xì)胞種植在多聚賴氨酸（美國(guó)Sigma公司）包被過的培養(yǎng)瓶之中，加入種植液，放入培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后，將原來的種植液吸出，換成含有NeurobasalA的培養(yǎng)液（美國(guó)Gibico公司）。每隔2～3 d根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行換液，培養(yǎng)至第8天。

1.2模型制備及分組

建立海馬神經(jīng)元細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型，以此模型模擬腦I/R損傷過程：將培養(yǎng)至第8天的神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)用無糖Earles液代替原培養(yǎng)液。培養(yǎng)6 h后，換回原培養(yǎng)條件進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)20 h。低氧復(fù)氧的過程中，在培養(yǎng)液中加入溶于體積分?jǐn)?shù)0.000 1二甲基亞砜（DMSO）的右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）。將海馬神經(jīng)元細(xì)胞按數(shù)字表法分成8組（每組6瓶）：正常對(duì)照組（C組，不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理）、賦形劑組（V組，不行低氧復(fù)氧處理，加體積分?jǐn)?shù)為0.000 1的DMSO培養(yǎng)6 h）、低氧復(fù)氧組（H/R組，采用氧糖剝奪法低氧6 h，復(fù)氧20 h，建立大鼠海馬神經(jīng)元低氧復(fù)氧損傷模型）、H/R+右美托咪定0.1 μmol/L組（D1組）、H/R+右美托咪定1.0 μmol/L組（D2組）、H/R+右美托咪定5.0 μmol/L組（D3組）、H/R+右美托咪定10.0 μmol/L組（D4組）、H/R+右美托咪定100.0 μmol/L組（D5組）。D1、D2、D3、D4、D5組在低氧復(fù)氧期間分別加入終濃度為0.1、1.0、5.0、10.0、100.0 μmol/L的右美托咪定，低氧培養(yǎng)6 h，復(fù)氧培養(yǎng)20 h。

1.3細(xì)胞活性測(cè)定

在96孔板中培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞。各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，移除培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗3次，根據(jù)細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明加入檢測(cè)溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.4細(xì)胞質(zhì)鈣離子熒光強(qiáng)度測(cè)定

用24孔板爬片培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞至第8天，各組細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，用Hanks液沖洗3次，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)試劑盒說明，每孔加入工作液100 μL，避光、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育45 min；移除工作液，用Hanks液沖洗細(xì)胞3次后，加入Hanks液100 μL，繼續(xù)避光、37 ℃孵育30 min。然后，移除Hanks液，以40 g/L多聚甲醛固定之后，在細(xì)胞爬片上滴入甘油防止猝滅，最后封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察鈣離子的熒光強(qiáng)度，用Image J軟件分析鈣離子熒光強(qiáng)度值。

1.5Western blot方法檢測(cè)線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1、Fis1和凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C（CytC）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的表達(dá)

提取各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞蛋白，用BCA法檢測(cè)提取的蛋白濃度。配制相應(yīng)的分離膠和濃縮膠，對(duì)提取的蛋白質(zhì)分別電泳、轉(zhuǎn)膜2 h，再用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗鼠單克隆一抗Drp1（美國(guó)Milipore公司，1∶400）、小鼠抗大鼠單克隆一抗CytC（美國(guó)Milipore公司，1∶1 000）、兔抗鼠單克隆一抗AIF（美國(guó)Milipore公司，1∶1 000）以及小鼠抗大鼠單克隆一抗Fis1（美國(guó)Milipore公司，1∶

1 000），4 ℃孵育過夜。大約12 h之后，用PBS洗膜3次，每次約10 min。然后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Milipore公司，1∶5 000）孵育2 h，PBS沖洗4次，每次約5 min?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色，X線底片曝光，使用Image Pro軟件分析結(jié)果。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得計(jì)量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，多組間均數(shù)比較若滿足正態(tài)分布以及方差齊性，則采用單因素方差分析，組與組之間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)；若多組數(shù)據(jù)間比較時(shí)方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)，組與組之間兩兩比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)并用Bonferroni法校正P值。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組神經(jīng)元細(xì)胞活性比較

與C組比較，H/R組神經(jīng)元和突觸的數(shù)量明顯減少；與H/R組比較，D1、D2、D3組神經(jīng)元和突觸數(shù)量明顯增多，而D4、D5組神經(jīng)元和突觸數(shù)量明顯減少。C組和V組之間的細(xì)胞活性比較差異無顯著性（P>0.05）；H/R組的細(xì)胞活性明顯低于C組和V組，D1、D2、D3組細(xì)胞活性明顯高于H/R組，而D4、D5組細(xì)胞活性低于H/R組，差異有顯著性（F=221.10，P<0.05）。見表1、圖1。由于D4、D5組右美托咪定處理細(xì)胞不但不會(huì)產(chǎn)生保護(hù)作用，反[LL]而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中舍棄了D4、D5組。

2.2各組細(xì)胞質(zhì)鈣離子熒光強(qiáng)度比較

V組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度與C組比較差異無顯著性（P>0.05）；H/R組鈣離子熒光強(qiáng)度與C組相比明顯升高，D1、D2、D3組鈣離子熒光強(qiáng)度低于H/R組，D2組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度低于D1、D3組，差異有顯著性（F=816.00，P<0.05）。見表1。

2.3各組線粒體分裂和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

C組和V組比較，Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表達(dá)差異無顯著性（P>0.05）。與C組比較，H/R組Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表達(dá)顯著增加；與H/R組比較，D1、D2、D3組Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表達(dá)顯著降低；其中D2組4種蛋白表達(dá)降低最明顯，差異有顯著性（F=399.20～577.26，P<0.05）。見圖2、表2。

3討論

I/R模型線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的作用已經(jīng)成為右美托咪定神經(jīng)保護(hù)機(jī)制體外研究的重點(diǎn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)初步揭示了右美托咪定可能通過作用于線粒體內(nèi)部相關(guān)結(jié)構(gòu)或是干擾部分因子的釋放從而抑制神經(jīng)元細(xì)胞I/R損傷過程中的凋亡[810]。目前，尚沒有研究探討右美托咪定對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用是否與線粒體分裂和融合之間的動(dòng)態(tài)平衡有聯(lián)系。

本文研究通過培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞采用氧糖剝奪法建立低氧復(fù)氧模型，作為大腦I/R損傷體外模型[1112]，探討右美托咪定對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞在H/R損傷過程中的作用。本文研究結(jié)果顯示，0.1～5.0 μmol/L濃度的右美托咪定對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用，尤其1.0 μmol/L濃度右美托咪定的保護(hù)作用最明顯；隨著劑量的加大，當(dāng)右美托咪定濃度超過10.0 μmol/L時(shí)，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制作用。右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）能夠一定程度降低由于H/R損傷導(dǎo)致的線粒體內(nèi)過高的鈣離子熒光強(qiáng)度，對(duì)細(xì)胞凋亡起到部分抑制作用。對(duì)大鼠腦I/R損傷研究顯示，右美托咪定可以有效減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制為上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax、P53的表達(dá)，同時(shí)也對(duì)線粒體膜的通透性有一

定的降低作用，從而抑制CytC、AIF等凋亡相關(guān)因

[LL]子從線粒體釋放到胞漿中[1314]。線粒體在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，研究顯示線粒體其實(shí)是一個(gè)不斷進(jìn)行分裂融合的動(dòng)態(tài)細(xì)胞器[1518]，這種動(dòng)態(tài)過程主要表現(xiàn)為分裂和融合處于平衡且對(duì)立的狀態(tài)。線粒體分裂涉及兩種蛋白，分別是Drp1蛋白和Fis1蛋白[19]。有研究表明，Drp1 Ser637作為Drp1的磷酸化位點(diǎn)可以被鈣離子依賴性的鈣調(diào)磷酸激酶去磷酸化，從而促進(jìn)線粒體的分裂[20]。本文研究通過檢測(cè)線粒體裂變蛋白的表達(dá)，探討右美托咪定抑制H/R誘導(dǎo)的線粒體裂變對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

[HJ2mm]結(jié)果顯示，右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）可能通過降低H/R損傷時(shí)Drp1和Fis1的表達(dá)來抑制線粒體的分裂，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

線粒體在I/R損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用，CytC作為呼吸鏈中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)在線粒體凋亡途徑中起到非常關(guān)鍵的作用[2122]。AIF作為一種凋亡誘導(dǎo)蛋白，通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)的濃縮和線粒體膜除極影響細(xì)胞凋亡的過程[2324]。右美托咪定可以減少?gòu)木€粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的CytC

量，抑制細(xì)胞中caspase9、caspase3和caspase6的激活，使caspase依賴程序性細(xì)胞凋亡受到抑制， AIF的表達(dá)也降低[25]。本文研究結(jié)果顯示， 0.1～5.0 μmol/L濃度右美托咪定可降低CytC和AIF的表達(dá)，且1.0 μmol/L濃度右美托咪定是發(fā)揮腦保護(hù)的最佳濃度。推斷右美托咪定可能通過降低Drp1和Fis1的表達(dá)來抑制線粒體的分裂，進(jìn)一步降低CytC和AIF的表達(dá)，抑制H/R損傷過程中的細(xì)胞凋亡。綜上所述，右美托咪定可能通過抑制線粒體分裂減輕低氧復(fù)氧對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

鈣離子在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載能夠引起線粒體膜電位除極以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，從而誘導(dǎo)線粒體凋亡的發(fā)生[2627]。本課題組先前的研究結(jié)果表明，線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體（MCU）可以將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子轉(zhuǎn)入到線粒體基質(zhì)中[2829]，通過調(diào)節(jié)MCU可以降低腦I/R損傷過程中的鈣離子的攝取，起到腦保護(hù)的作用[30]。本文的研究結(jié)果還顯示，右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）降低Drp1和Fis1表達(dá)的同時(shí)伴隨著鈣離子熒光強(qiáng)度的降低，推測(cè)右美托咪定可能是通過抑制胞漿鈣超載誘導(dǎo)的線粒體膜電位除極和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，抑制線粒體凋亡 [31]。

雖然右美托咪定對(duì)于H/R損傷過程中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用，但是，影響線粒體分裂的因素有很多，同時(shí)影響鈣離子濃度的因素也很多，例如興奮性氨基酸的產(chǎn)生等。本文僅探討右美托咪定對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞H/R損傷過程中的直接影響，右美托咪定能減輕低氧復(fù)氧對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能是通過抑制線粒體分裂發(fā)揮作用。

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