張 妍,邵玉健,黃 睿,林昌岫,康東周,*

(1.延邊大學(xué) 藥學(xué)院,吉林延吉 133002;2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗室,吉林延吉133000)

輪葉黨參(Codonopsislanceolata)又名山胡蘿卜、山地瓜、羊乳等,為桔?？泣h參屬藥用植物,以根入藥,是長白山珍貴的藥食兩用的植物[1]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為輪葉黨參可以強(qiáng)身壯力、補(bǔ)虛潤肺、通乳排膿、解毒療瘡的功效[2],而據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究,輪葉黨參具有抗癆病、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、抗突變等作用[3]。

植物多糖是從天然植物中提取的一種具有生物活性的物質(zhì),經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),許多植物多糖都具有提高機(jī)體免疫功能的作用,并進(jìn)行了深入地研究,而輪葉黨參粗多糖對機(jī)體免疫機(jī)能方面研究卻鮮少有報道。所以,研究輪葉黨參粗多糖相關(guān)免疫調(diào)節(jié)作用對于輪葉黨參保健功能的開發(fā)具有很大的意義。

本文旨在研究輪葉黨參粗多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性免疫功能及RAW 264.7作用下非特異性免疫功能的影響,為輪葉黨參粗多糖的開發(fā)和利用建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

輪葉黨參 經(jīng)延邊大學(xué)藥物分析教研室康東周副教授鑒定為長白山道地藥材輪葉黨參。6～8周齡BALB/C小鼠 延邊大學(xué)動物實(shí)驗中心;RAW 264.7 武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶 美國Hyclong公司;RPMI-1640培養(yǎng)基 賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司;MTT、DMSO、磷酸鹽緩沖溶液 北京索萊寶公司;小鼠細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒 美國BD公司;LPS、NEDD、Sulfanilamide、ConA 美國sigma公司;RT-PCR試劑盒 Promega公司。

酶聯(lián)免疫檢測儀 美國伯騰儀器有限公司;二氧化碳培養(yǎng)箱 Thermo公司;低溫高速離心機(jī) BECKMAN公司;倒置顯微鏡 Olympus公司;超凈工作臺 BIOAIR公司;PCR儀 BIO-RAD公司;凝膠成像儀 Proteinsimple公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 小鼠脾臟細(xì)胞制備 脫頸處死BALB/C小鼠,于75%乙醇中完全浸泡2 min,在無菌環(huán)境下取出小鼠脾臟,將脾臟置于200目銅篩上邊研磨邊用RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗過濾,收集濾液于4 ℃ 1000 r/min離心后棄上清,再用RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗、吹打,自離心至吹打如此過程重復(fù)三次即得小鼠脾臟細(xì)胞[4]。

1.2.2 輪葉黨參粗多糖及溶液的制備 采用水提醇沉法,料液比為1∶10,水提溫度80 ℃,浸提3 h,40 ℃濃縮,加入乙醇至乙醇終濃度為65%[5]。醇沉后,丙酮、乙醚洗滌沉淀,用Savage法除蛋白[6],經(jīng)冷凍干燥得輪葉黨參粗多糖。將輪葉黨參粉末按相應(yīng)濃度溶于含10% FBS RPMI-1640培養(yǎng)基中,無菌環(huán)境用0.3 μm濾膜過濾。

1.2.3 脾淋巴細(xì)胞分組與培養(yǎng)

1.2.3.1 實(shí)驗分組 正常組(只含細(xì)胞),陽性對照組(ConA終濃度為5 μg/mL),用藥組(ConA+輪葉黨參粗多糖,ConA終濃度為5 μg/mL,多糖終濃度分別為1000、500、250、125 μg/mL,用藥組各含5 μL/mL ConA)。

1.2.3.2 ELISA法檢測IL-2、IFN-γ分泌水平 將剛分離的小鼠脾臟細(xì)胞以2.5×106個/孔接種于48孔(終體積為400 μL)細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)4 h后,按分組給藥,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-2,IFN-γ濃度。

1.2.4 RAW 264.7分組與培養(yǎng)

1.2.4.1 實(shí)驗分組 正常組(只含細(xì)胞),陽性對照組(LPS終濃度為2 μg/mL),用藥組(輪葉黨參粗多糖終濃度為1000、500、250、125 μg/mL)。

1.2.4.2 RAW 264.7 的細(xì)胞增殖活性測定 將RAW 264.7以1×104個/孔接種于96孔(終體積為200 μL)細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)4 h后,按分組給藥,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)培養(yǎng)箱孵育4 h后,吸出細(xì)胞上清,每孔加入100 μL DMSO溶解,在570 nm波長處測定吸光度。

細(xì)胞相對增殖率(%)=(實(shí)驗組吸光度值/空白對照組吸光度值)×100

1.2.4.3 ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平 將RAW 264.7細(xì)胞以2.5×105個/孔接種于48孔(終體積為400 μL)細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)4 h后,按分組給藥,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞上清液用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-2、IFN-γ濃度。

1.2.4.5 RT-PCR法檢測iNOS mRNA的表達(dá) 將RAW 264.7細(xì)胞以2×106個/孔接種于48孔(終體積為400 μL)細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)4 h后,分組給藥,劑量組質(zhì)量濃度為1000 μg/mL,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄上清。mRNA的提取,RNA逆轉(zhuǎn)錄與cDNA合成的方法均按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列β-actin:反義:5′-CAGGTCCCGG CCAGCCAGGT -3′;正義:5′-CACCCGCCACCAG TTCGCCA-3′;iNOS:反義:5′-CTCCTTTGAGCCC TTTGT -3′;正義:5′-GAGCGAGTTGTGGATTGTC-3′。按照以下參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng):β-actin:先 95 ℃ 預(yù)變性5 min,然后95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,30個循環(huán),最后一個循環(huán)72 ℃ 7 min。iNOS:先95 ℃預(yù)變性5 min,然后95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35個循環(huán),最后一個循環(huán)72 ℃ 7 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 輪葉黨參粗多糖對脾淋巴細(xì)胞IL-2生成量的影響

不同濃度的輪葉黨參粗多糖和5 μg/mL ConA作用于脾淋巴細(xì)胞后,IL-2生成量極顯著高于正常組(只含細(xì)胞)與陽性對照組(ConA組)(p<0.01),見表1。ConA具有刺激脾淋巴細(xì)胞增殖的作用,使得在陽性對照組中ConA的作用下,IL-2濃度極顯著高于正常組(p<0.01)。而在劑量組中,與陽性對照組相比,IL-2濃度隨著劑量的加大而增加。表明在劑量為125～1000 μg/mL范圍內(nèi),輪葉黨參粗多糖可以發(fā)揮協(xié)同作用,極顯著促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2(p<0.01)。

表1 輪葉黨參粗多糖對脾淋巴細(xì)胞 分泌IL-2的影響Table 1 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IL-2 production by mouse spleen

2.2 輪葉黨參粗多糖對脾淋巴細(xì)胞IFN-γ生成量的影響

不同濃度的輪葉黨參粗多糖和5 μg/mL的ConA作用于脾淋巴細(xì)胞后,IFN-γ生成量極顯著高于正常組與陽性對照組(ConA組)(p<0.01),見表2。ConA具有刺激脾淋巴細(xì)胞增殖的作用,使得在陽性對照組中ConA的作用下,IFN-γ濃度極顯著高于正常組。而在各劑量組中,與陽性對照組相比,IFN-γ濃度隨著劑量的加大而增加。表明在劑量為125～1000 μg/mL范圍內(nèi),輪葉黨參粗多糖可以發(fā)揮協(xié)同作用,極顯著促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ(p<0.01)。

表2 輪葉黨參粗多糖對脾淋巴細(xì)胞分泌 IFN-γ的影響Table 2 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IFN-γ production by mouse spleen

2.3 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7細(xì)胞的增殖的影響

由表3可得,不同濃度的輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7細(xì)胞與正常組比較增殖作用顯著(p<0.05)。劑量濃度為125～1000 μg/mL時,均顯著有細(xì)胞增殖能力。當(dāng)劑量濃度為250或500 μg/mL時,其增殖效果相近。而濃度為1000 μg/mL時,促進(jìn)細(xì)胞增殖能力最大。

表3 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7細(xì)胞的 增殖的影響Table 3 Proliferation effect of Codonopsis lanceolata polysaccharide on cultured RAW

2.4 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 TNF-α、IL-6生成量的影響

由表4、表5可得,不同濃度的輪葉黨參粗多糖作用于RAW 264.7細(xì)胞后,TNF-α,IL-6濃度極顯著高于正常組(p<0.01)。可見在劑量濃度在125～1000 μg/mL范圍內(nèi)時,TNF-α,IL-6分泌量增加效果明顯,甚至高于LPS組。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為 1000 μg/mL時,TNF-α,IL-6生成量最大。

表4 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 分泌TNF-α的影響Table 4 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on TNF-α production by RAW

表5 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 分泌IL-6的影響Table 5 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IL-6 production by RAW

2.5 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 NO生成量的影響

由表6可得,不同濃度的輪葉黨參粗多糖作用于RAW 264.7細(xì)胞后,NO生成量極顯著高于正常組(p<0.01)?？梢娫趧┝繚舛仍?25～1000 μg/mL范圍內(nèi)時,NO分泌量增加明顯,甚至高于LPS組,且隨著濃度劑量增加而增多。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為 1000 μg/mL時,NO生成量最大,作用最顯著。

表6 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 分泌NO的影響Table 6 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on NO production by RAW

2.6 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 iNOS mRNA表達(dá)的影響

由圖1可知,輪葉黨參劑量為1000 μg/mL時,iNOS中LPS組與輪葉黨參多糖組光斑強(qiáng)度明顯高于正常組,且β-actin中各組量接近。由此得出,RAW 264.7在輪葉黨參粗多糖的作用下可增加對iNOS mRNA的生成。而輪葉黨參粗多糖可能通過提高RAW 264.7 iNOS mRNA表達(dá),調(diào)節(jié)增加NO的釋放量。

圖1 輪葉黨參多糖作用RAW 264.7 細(xì)胞后,iNOS mRNA的表達(dá)Fig.1 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on iNOS mRNA production by RAW 264.7

3 討論

脾臟是人體最大的免疫器官,含有大量淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞,參與特異性免疫與非特異性免疫應(yīng)答[7]。ConA可以刺激脾臟細(xì)胞中脾淋巴細(xì)胞,是T細(xì)胞促有絲分裂劑,主要參與特異性免疫應(yīng)答,可以刺激脾臟細(xì)胞中脾淋巴細(xì)胞。IL-2是機(jī)體發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,其在免疫調(diào)節(jié)中尤其是特異性免疫方面起重要作用。IL-2可以參與T淋巴細(xì)胞的增殖與分化,增強(qiáng)一些細(xì)胞活性,例如:Tc細(xì)胞、NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞活性等[8],并且可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。而IFN-γ具備免疫調(diào)節(jié)的活性[9],可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞免疫功能[10]。Wang 等[11]實(shí)驗證明大葉南五味子多糖能夠體外刺激雞脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2,IFN-γ來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能。鄭乃珍等[12]研究表明猴頭菇多糖能夠協(xié)同ConA對小鼠脾細(xì)胞分泌Th1(IL-2、TNF-α、INF-γ)、Th2(IL-6、IL-4)細(xì)胞因子及基因表達(dá)的影響從而促進(jìn)機(jī)體雙重免疫調(diào)節(jié)。王思蘆等[13]報道雞樅菌多糖可明顯促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4、IL-2、INF-γ細(xì)胞因子,增強(qiáng)小鼠T細(xì)胞免疫功能的影響。

IL-6能誘導(dǎo)活化B細(xì)胞,促使其分泌抗體,參與T細(xì)胞的活化、增殖及分化[14]。TNF-α增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性和殺傷功能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞促免疫應(yīng)答的能力[15-16]。NO被認(rèn)為是一種重要的活性介質(zhì),免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的NO分子在宿主免疫防御、組織修復(fù)等生理活動中發(fā)揮重要的作用[17]。巨噬細(xì)胞生成的NO具有細(xì)胞毒作用,既可殺傷侵入機(jī)體的有害物質(zhì),又能夠抑制癌細(xì)胞的增殖[18]。楊修仕等[19]研究顯示西洋參多糖可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α、IL-6及IL-10細(xì)胞因子,因而具備較強(qiáng)免疫活性。郝慧慧等[20]研究表明紅毛五加多糖可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、NO,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力,可活化巨噬細(xì)胞,起到免疫正向調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞對非特異性免疫發(fā)揮重要作用,可以通過分泌各種細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力[21]。NO的合成主要受一氧化氮合酶(NOS)的調(diào)節(jié)。NOS有三種亞型,即nNOS,eNOS,iNOS[22]。楊興斌等[23]研究證明當(dāng)歸多糖通過增強(qiáng)表達(dá)iNOS mRNA,合成蛋白質(zhì)來誘使巨噬細(xì)胞分泌NO。

4 結(jié)論

本文中輪葉黨參粗多糖可以促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ,濃度極顯著高于陽性對照組(p<0.01),即可認(rèn)為輪葉黨參粗多糖為T細(xì)胞功能的促進(jìn)劑,與ConA協(xié)同作用于T淋巴細(xì)胞,具有增強(qiáng)T細(xì)胞免疫活性的功能。輪葉黨參粗多糖也可顯著促進(jìn)RAW264.7的增殖(p<0.05),極顯著增加RAW264.7分泌IL-6、TNF-α、NO(p<0.01),即可說明輪葉黨參粗多糖可活化、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性等作用,從而發(fā)揮增強(qiáng)非特異性免疫的作用。同時,本文還檢測了iNOS mRNA的表達(dá),結(jié)果證明其能夠明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平,提示輪葉黨參粗多糖通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá),從而提高NO的生成。綜上表明,輪葉黨參粗多糖可增加脾淋巴細(xì)胞與RAW264.7分泌IL-2、IFN-γ、IL-6、TNF-α、NO,促進(jìn)RAW 264.7增殖,iNOS mRNA表達(dá),對以T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞發(fā)揮主要作用的特異性免疫與非特異性免疫活性有正向調(diào)節(jié)的作用,為輪葉黨參的進(jìn)一步研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。