陳建平,龐藝萌,劉 穎,劉 海,鐘賽意,諶素華,秦小明,*

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省亞熱帶果蔬加工現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088;2.廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510640;3.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣東湛江 524088)

姜黃素(Curcumin)是一種從姜黃根莖中提取出來(lái)的黃酮類(lèi)化合物[1]。作為一種天然的食用色素,姜黃素是世界衛(wèi)生組織和美國(guó)食品藥品管理局以及多國(guó)準(zhǔn)許使用的食品添加劑[2]。近年來(lái),大量的臨床研究表明,姜黃素具有抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5-6]、抗炎[7-8]、清除自由基、抗衰老等諸多功效。然而,由于姜黃色素難溶于水,不便于注射給藥,所以目前姜黃素的動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究以至臨床實(shí)驗(yàn)研究多采用口服給藥的方法。這一難溶性特點(diǎn)極大地限制了它在食品和醫(yī)藥中的應(yīng)用價(jià)值。

β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin)是由7個(gè)葡萄糖分子以α-1,4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖化合物,是一種良好的包合材料[9-10]。研究表明,β-環(huán)糊精與姜黃素形成的包合物能有效誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡[11]。而且,Yallapu 等[12]也發(fā)現(xiàn),相比單獨(dú)的姜黃素,β-環(huán)糊精與姜黃素形成的包合物具有更好的抗腫瘤效果。然而,考慮到如果直接采用環(huán)糊精作為藥物載體,存在其自身水溶性低的問(wèn)題,因此,課題組前期應(yīng)用超分子化學(xué)的理論,采用聚合反應(yīng)把環(huán)糊精合成為具有水溶性良好的環(huán)糊精聚合物作為藥物載體成功制備了姜黃素超分子包合物。目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有關(guān)姜黃素超分子包合物的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)的報(bào)道。因此,為了對(duì)姜黃素超分子包合物的抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià),本文采用CCK8比色法檢測(cè)姜黃素超分子包合物對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞、Hela宮頸癌細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞四種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,并進(jìn)一步運(yùn)用Annexin-V/PI雙染檢測(cè)姜黃素超分子包合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的原因。該研究結(jié)果為姜黃素超分子包合物在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素超分子包合物 實(shí)驗(yàn)室自制[13];胎牛血清、青霉素、鏈霉素 美國(guó)Gibco公司;RPMI-1640 美國(guó)Hyclone公司;Trysin-EDTA溶液 美國(guó)GENVIEW公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8) Dojindo公司;Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 聯(lián)科生物公司;96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)NEST公司;人黑色素瘤細(xì)胞A375、人肺癌細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 美國(guó)ATCC公司。

BP301S電子天平 德國(guó)Sartorius公司;TDL-80-2B低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;INC108 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 德國(guó)Memmer公司;Multiscan MK3酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司;倒置熒光顯微鏡 MOTIC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 姜黃素超分子包合物的制備 參照陳建平[13]等的方法進(jìn)行制備。稱(chēng)取15.76 g NaOH于三口燒瓶中,加32 mL H2O,攪拌溶解。再稱(chēng)取20 gβ-環(huán)糊精,加入三口燒瓶,攪拌全溶至澄清,在30 ℃下緩慢加入環(huán)氧氯丙烷(EPC)9.64 mL,攪拌24 h,冷卻至室溫。將反應(yīng)液倒入錐形瓶中,超聲5 min。將溶液倒入透析袋中(先用水潤(rùn)濕清洗,再用蒸餾水洗滌兩次),放入盛有蒸煙水的大燒杯屮透析,開(kāi)始時(shí)每小時(shí)換一次蒸餾水,之后延長(zhǎng)時(shí)間更換水,透析至中性。將透析袋中溶液抽濾,濾去不溶物,然后用0.45 μm的纖維素膜過(guò)濾,過(guò)濾后進(jìn)行旋蒸,蒸至粘稠狀,加入無(wú)水乙醇析出白色固體,過(guò)濾,真空干燥,得環(huán)糊精聚合物。將姜黃素和環(huán)糊精聚合物按質(zhì)量比1∶4混勻,加入研缽中研磨,研磨均勻后倒入錐形瓶中,加入50 mL水,超聲5 min,功率120 W。將錐形瓶放磁力攪拌器上攪拌2 d后,將包合物溶液抽濾,除去未溶解的姜黃素,再將溶液進(jìn)行旋蒸,真空干燥,即得水溶性姜黃素超分子包合物。

1.2.2 姜黃素超分子包合物的抗腫瘤活性測(cè)定

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)在含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和50 U/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中。細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃,5% CO2)72 h后,根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于以下CCK-8實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),經(jīng)細(xì)胞傳代后,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL。將四種腫瘤細(xì)胞(A375細(xì)胞、A549細(xì)胞、Hela細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞)以每孔100 μL接種于 96 孔培養(yǎng)板,置于培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)培養(yǎng) 24 h。往不同的96孔板中分別加入不同濃度的姜黃素超分子包合物(0、40、80、160、320、640 μg/mL)。經(jīng)不同濃度的姜黃素超分子包合物處理的五種腫瘤細(xì)胞分別培養(yǎng) 24、48和72 h后。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。然后,往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入CCK-8,每孔10 μL,放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h 后,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm處測(cè)定各孔OD值,以空白對(duì)照組的OD值為100%,根據(jù)如下公式計(jì)算不同處理組中的細(xì)胞存活率[14]。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如式(1):

細(xì)胞存活率(%)=Ai/A0×100

式(1)

其中,Ai表示不同處理組的OD值;A0表示空白對(duì)照組的OD值。

1.2.2.3 比較姜黃素超分子包合物對(duì)四種腫瘤細(xì)胞處理不同時(shí)間后的IC50值 以各個(gè)濃度的細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo),相應(yīng)濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)作散點(diǎn)圖,進(jìn)行線(xiàn)性擬合,得出線(xiàn)性方程。將存活率為 50%代入到線(xiàn)性方程中,從而計(jì)算出細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 Annexin-V/PI雙染檢測(cè)A375細(xì)胞凋亡 參考Zhang等的方法進(jìn)行[15]。取A375對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),經(jīng)細(xì)胞傳代后,調(diào)整細(xì)胞密度。以1×105細(xì)胞/孔接種于6孔板,置于培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)培養(yǎng)24 h后,加入不同濃度的姜黃素超分子包合物(0、80、160、320、640 μg/mL)孵育72 h,然后,用胰酶將細(xì)胞消化下來(lái),在1000 r/min下離心5 min,經(jīng)PBS洗2次,收集細(xì)胞。經(jīng)500 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞后,加入5 μL Annexin V-FITC混勻,然后再加入10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混勻,孵育15 min后,采用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm的條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素超分子包合物對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度的姜黃素超分子包合物對(duì)A375細(xì)胞作用處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1所示。由圖1可知,當(dāng)姜黃素超分子包合物處理A375細(xì)胞24 h后,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細(xì)胞存活率從103.5%±2.6%降低到94.9%±1.1%。當(dāng)處理時(shí)間增加到72 h時(shí),隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細(xì)胞存活率從92.7%±0.9%降低到43.0%±1.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間和濃度范圍內(nèi),A375細(xì)胞存活率均隨姜黃素超分子包合物濃度的升高和處理時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。這種趨勢(shì)的原因可能是由于姜黃素超分子包合物隨著處理時(shí)間和濃度的增加,包合物可能被細(xì)胞吸收,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)吸收的包合物達(dá)到一定量后,包合物可能會(huì)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)的表達(dá)變化,從而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖1 不同濃度的姜黃素超分子包合物 對(duì)A375細(xì)胞處理不同時(shí)間后對(duì)其存活率的影響Fig.1 Effects of different concentration of curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex on cell viability of A375 cells at different treatment times注:不同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異(p<0.05)，相同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異;圖2～圖4同。

2.2 姜黃素超分子包合物對(duì)A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度的姜黃素超分子包合物對(duì)A549細(xì)胞作用處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2所示。由圖2可知,當(dāng)姜黃素超分子包合物處理A549細(xì)胞24 h后,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細(xì)胞存活率從98.3%±2.2%降低到92.5%±2.3%。當(dāng)處理時(shí)間增加到72 h時(shí),隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細(xì)胞存活率從95.5%±4.3%降低到44.5%±1.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間和濃度范圍內(nèi),A549細(xì)胞存活率均隨姜黃素超分子包合物濃度的升高和處理時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。

圖2 不同濃度的姜黃素超分子包合物 對(duì)A549細(xì)胞作用處理時(shí)間后對(duì)其細(xì)胞存活率的影響。Fig.2 Effects of different concentration of curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex on cell viability of A549 cells at different treatment times

2.3 姜黃素超分子包合物對(duì)Hela宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度的姜黃素超分子包合物對(duì)Hela細(xì)胞作用處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3所示。由圖3可知,當(dāng)姜黃素超分子包合物處理Hela細(xì)胞24 h后,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細(xì)胞存活率從101.2%±2.1%降低到82.1%±2.1%。當(dāng)處理時(shí)間增加到72 h時(shí),隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細(xì)胞存活率從89.9%±4.1%降低到50.1%±1.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間和濃度范圍內(nèi),Hela細(xì)胞存活率均隨姜黃素超分子包合物濃度的升高和處理時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。

圖3 不同濃度的姜黃素超分子包合物 對(duì)Hela細(xì)胞處理不同時(shí)間后對(duì)其細(xì)胞存活率的影響。Fig.3 Effects of different concentration of curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex on cell viability of Hela cells at different treatment times

2.4 姜黃素超分子包合物對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度的姜黃素超分子包合物對(duì)MCF-7細(xì)胞處理不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4所示。由圖4可知,當(dāng)姜黃素超分子包合物處理MCF-7細(xì)胞24 h后,隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細(xì)胞存活率從96.5%±5.0%降低到77.4%±2.5%。當(dāng)處理時(shí)間增加到72 h時(shí),隨著姜黃素超分子包合物濃度的升高,細(xì)胞存活率從95.7%±2.8%降低到59.4%±4.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間和濃度范圍內(nèi),MCF-7細(xì)胞存活率均隨姜黃素超分子包合物濃度的升高和處理時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。

圖4 不同濃度的姜黃素超分子包合物 對(duì)MCF-7細(xì)胞處理不同時(shí)間后對(duì)其細(xì)胞存活率的影響。Fig.4 Effects of different concentration of curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex on cell viability of MCF-7 cells at different treatment times

2.5 姜黃素超分子包合物對(duì)四種腫瘤細(xì)胞處理不同時(shí)間后的IC50比較

為了更直觀的比較姜黃素超分子包合物對(duì)這四種細(xì)胞的抗腫瘤活性作用,本文通過(guò)計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)來(lái)進(jìn)行比較[16]。計(jì)算結(jié)果如表1所示。由表1可知,不同濃度的姜黃素超分子包合物(40～640 μg/mL)對(duì)A375細(xì)胞、A549細(xì)胞、Hela細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞作用24 h后計(jì)算其IC50分別為2202.8、1830.8、1026.9和987.6 μg/mL,當(dāng)處理時(shí)間增加到72 h后,發(fā)現(xiàn)其IC50分別下降到476.4、517.2、545.7和692.8 μg/mL,結(jié)果表明,隨著處理時(shí)間的增加,姜黃素超分子包合物對(duì)四種細(xì)胞的IC50均呈下降趨勢(shì),且姜黃素超分子包合物對(duì)A375細(xì)胞處理72 h時(shí),其IC50值達(dá)到最低為476.4 μg/mL,這表明姜黃素超分子包合物對(duì)A375細(xì)胞處理72 h時(shí),抑制A375細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)。因此,本文選擇對(duì)A375細(xì)胞處理72 h進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞凋亡機(jī)理初探。

表1 姜黃素超分子包合物 對(duì)不同細(xì)胞作用不同時(shí)間的 IC50 值Table 1 IC50 of different cells exposed to curcumin/ β-cyclodextrin polymer inclusion complex for different times

2.6 Annexin-V/PI雙染檢測(cè)A375細(xì)胞凋亡

在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程中,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡往往是目前被認(rèn)為抑制細(xì)胞增殖的主要原因[17-18]。為了進(jìn)一步闡明姜黃素超分子包合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)理,本文選擇對(duì)姜黃素超分子包合物具有抑制作用最強(qiáng)的A375細(xì)胞作為研究對(duì)象,采用Annexin-V/PI 雙染檢測(cè)姜黃素超分子包合物對(duì)A375細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況。AnnexinV是一種與膜磷脂酰絲氨酸(PS)具有高度結(jié)合力的磷脂結(jié)合蛋白,而碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種不能透過(guò)正常細(xì)胞細(xì)胞膜的核酸染料。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),在凋亡早期,PS會(huì)由脂膜的內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合,而在凋亡的中晚期,細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加,PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅,因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處于早期凋亡細(xì)胞、死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)[19-20]。Annexin-V/PI 雙染檢測(cè)A375細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,對(duì)照組中凋亡細(xì)胞數(shù)量為3.3%,當(dāng)經(jīng)80 μg/mL姜黃素超分子包合物處理A375細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡數(shù)量從對(duì)照組的 3.3%上升到 20.7%。并且,當(dāng)姜黃素超分子包合物的濃度提高到640 μg/mL時(shí),其細(xì)胞凋亡總數(shù)從20.7%提高到35.0%。上述結(jié)果表明,姜黃素超分子包合物抑制A375細(xì)胞增殖主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖5 不同濃度的姜黃素超分子包合物對(duì)A375細(xì)胞凋亡數(shù)目的影響。Fig.5 Effects of different concentration of curcumin/β-cyclodextrin polymer inclusion complex on population of apoptotic A375 cells

3 結(jié)論

本文采用CCK8比色法檢測(cè)姜黃素超分子包合物對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞、Hela宮頸癌細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞四種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,姜黃素超分子包合物抑制四種腫瘤細(xì)胞的增殖均呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。而且,姜黃素超分子包合物對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞的抑制活性最強(qiáng)(72 h后的抑制率達(dá)到了43.0%±1.2%),其次是A549肺癌細(xì)胞(72 h后的抑制率達(dá)到了44.5%±1.2%),而對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的抑制活性最弱(72 h后的抑制率達(dá)到了59.4%±4.2%)。并且,通過(guò)比較姜黃素超分子包合物對(duì)四種腫瘤細(xì)胞作用的IC50值也發(fā)現(xiàn)姜黃素超分子包合物抑制A375細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng),其IC50達(dá)到最低為476.4 μg/mL。運(yùn)用Annexin-V/PI 雙染進(jìn)一步檢測(cè)姜黃素超分子包合物抑制A375細(xì)胞增殖的原因,發(fā)現(xiàn),姜黃素超分子包合物抑制A375細(xì)胞增殖主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而,對(duì)于姜黃素超分子包合物如何誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制還不清楚,有待于下一步的研究。