張丹妍，楊玉有，楊智曦，李新生，呂 靜，馬明福，李練兵

（重慶市人口和計劃生育科學技術(shù)研究院/國家衛(wèi)生計生委出生缺陷與生殖健康重點實驗室/重慶市正鼎司法鑒定所，重慶 400020）

短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats，STR）普遍存在于人類基因組中，是具有多態(tài)性的一類DNA序列。STR通常由2～6 bp核心序列串聯(lián)重復而成，重復次數(shù)從幾次到幾十次不等[1-2]。STR具有種類多、分布廣、多態(tài)性高、擴增成功率高、檢測靈敏、重復性好、高雜合度、容易檢測并遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律等特點，在法醫(yī)學親子鑒定、個體識別及遺傳病連鎖分析等方面應(yīng)用廣泛[3-5]。但是法醫(yī)學檢案過程中，STR基因座的突變現(xiàn)象不少見，會一定程度上影響案件結(jié)論，因此，法醫(yī)學實踐中學者們對突變現(xiàn)象日益關(guān)注。在美國人群中，父源基因突變率在0.007%～0.371%之間（來自美國血庫協(xié)會研究報道）[6]；而STR基因突變率國內(nèi)學者研究報道在0.004%～0.404%之間[7-10]。本研究選擇了2016年度重慶地區(qū)人群的1596例支持存在親權(quán)關(guān)系的案件為觀察研究對象，分析案件中22個常染色體STR基因座突變情況及特點，以期儲備重慶地區(qū)STR 基因突變的基礎(chǔ)遺傳學信息?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1596例親子鑒定案例均來自重慶市正鼎司法鑒定所的日常檢測案例，三聯(lián)體（父親—孩子—母親）親子鑒定案件563例，二聯(lián)體（父親—孩子或母親—孩子）1033例，鑒定結(jié)論均為支持存在親權(quán)關(guān)系。家系案例樣本大部分為血液或血斑，小部分為唾液斑、帶毛囊毛發(fā)。

1.2 儀器和試劑

VeritiTM96-Well Thermal Cycler PCR 擴增儀（ 美國AB公司）；3130型或3500型DNA遺傳分析儀（美國AB公司）；AGCU Expressmarker22 熒光檢測試劑盒（簡稱AGCU Ex22 kit）和AGCU 21+1 STR熒光檢測試劑盒（簡稱AGCU 21+1 kit）（中國無錫中德美聯(lián)公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

樣本的基因組DNA采用Chelex-100法提取。

1.3.2 PCR擴增

采用AGCU Ex22 kit對22個STR基因座（D3S1358、D13S317、D7S820、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、D16S539、Penta E、CSF1PO、Penta D、D10S1248、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391和FGA）及1個性別基因座Amelogenin進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）復合擴增。PCR擴增體系為10 μL，每管含Reaction Mix 4.0 μL、EX22 Primers 2.0 μL、熱啟動C-Taq酶0.4 μL、DNA模板1.0 μL（DNA濃度為0.5～2 ng/μL）和sdH2O 2.6 μL。PCR循環(huán)條件為初始變性95℃ 2 min，熱循環(huán)（10個循環(huán)：94℃ 2 min，60℃ 1 min，72℃1 min；20個循環(huán)：90℃2 min，58℃1 min，72℃1 min），終延伸72℃ 10 min，保溫4℃維持。每個擴增體系中設(shè)立陽性對照DNA為女性細胞株9947A和陰性對照（空白DNA用去離子水替代）。若出現(xiàn)1-2個不符合遺傳規(guī)律的STR基因座，加測AGCU 21+1 kit。AGCU 21+1 Kit含22個STR基因座（D10S1248、D6S474、D12ATA63、D2S441、D22S1045、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D19S433、D6S1017、D4S2408、D17S1301、D2S1776、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D10S1435和D5S2500）及1個性別基因座Amelogenin，其中D10S1248、D2S441和D19S433這3個STR基因座為AGCU EX22 kit和AGCU 21+1 kit共有，可以進行復核比對。AGCU 21+1 kit的PCR擴增體系為10 μL，每管含Reaction Mix 4.0 μL、Primers 21+1 2.0 μL、熱啟動C-Taq酶0.3 μL、DNA模板1.0 μL（DNA濃度為0.5～2 ng/μL）和sdH2O 2.7 μL。每個擴增體系中設(shè)立陽性對照DNA為女性細胞株9947A和陰性對照（空白DNA用去離子水替代）。PCR循環(huán)條件為初始變性95℃ 2 min，熱循環(huán)（30個循環(huán)：94℃ 30sec，60℃ 1 min，65℃ 1.5 min），終延伸60℃1 hour，保溫4℃維持。

1.3.2 STR基因座檢測

使用3130或3500遺傳分析儀對擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳，用Gene Mapper ID v3.2或Gene Mapper?ID-X軟件對STR基因座進行分析。分型標準含分子量內(nèi)標和等位基因分型標準物。

1.3.3 STR突變基因的確定

如果所有檢測的22個STR基因座均符合孟德爾遺傳規(guī)律，并且累計親權(quán)指數(shù)（CPI）大于10000，則支持存在親權(quán)關(guān)系。如果有1或2個STR基因座結(jié)果違反遺傳規(guī)律或CPI在0.0001至10000之間，本研究增加AGCU 21+1 kit檢測。參照司法部《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（SF/ZJD0105001-2016）計算突變基因座的PI。如果增加檢測試劑盒沒有發(fā)現(xiàn)新的違反遺傳規(guī)律基因座并且計算CPI大于10000，那么支持存在親權(quán)關(guān)系。該違反遺傳規(guī)律的基因座認為是突變基因座。如果CPI小于0.0001，認為排除存在親權(quán)關(guān)系[11]。

1.3.4 STR基因座突變分析方法

突變步數(shù)即為重復單位的增加（+n）或者減少（-n）。在父母的等位基因中，突變基因以重復單位相差最小的親代等位基因為準。如果步數(shù)相差相同，突變基因參考結(jié)構(gòu)相似的等位基因。如果步數(shù)相同、結(jié)構(gòu)相似即增加或者減少步數(shù)相同則判斷為不能確定[9]。對突變基因座的數(shù)量、突變來源、突變步數(shù)及重復單位的增加或減少進行統(tǒng)計，通過直接計數(shù)法和EXCEL軟件計算突變基因座的突變率。另外，分析突變來源、突變步數(shù)在整體突變事件中所占比例。突變相關(guān)因素之間的關(guān)系利用SPSS 15.0軟件進行分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 STR基因突變座分析

1596例支持存在親權(quán)關(guān)系的親子鑒定案例中，二聯(lián)體案件有1033例，三聯(lián)體案件有563例，共觀察到2159次減數(shù)分裂。研究中觀察到52例突變（二聯(lián)體案件有22例，三聯(lián)體案件有30例），其中51例是父親或母親一方有1個基因座發(fā)生突變（98.11%），1例為父親和母親各有1個基因座發(fā)生突變（1.89%）。22個被檢測的STR基因座中有20個座觀察到突變，F(xiàn)GA基因座的突變率最高，為9次（0.42%），其次D12S391基因座為6次（0.28%），Penta E基因座為5次（0.23%），D8S1179和vWA基因座為4次（0.19%），D13S317、TH01和D2S1338基因座為3次（0.14%），D16S539、CSF1PO、Penta D、D10S1248和D6S1043基因座為2次（0.09%），D3S1358、D7S820、D21S11、D18S51、D5S818為1次（0.05%）。此外，D2S441和TPOX基因座未觀察到突變（表1）。

STR基因座 突變例數(shù) 突變率（%） 一步突變 兩步突變（-2） 三步突變（+3）+1 -1 +1或-1 +3 -3 D3S1358 1 0.05（1/2159） 1 D13S317 3 0.14（3/2159） 1 1 1 D7S820 1 0.05（1/2159） 1 D16S539 2 0.09（2/2159） 2 Penta E 5 0.23（5/2159） 2 1 2 TH01 3 0.14（3/2159） 1 1 1 D2S1338 3 0.14（3/2159） 1 1 1 CSF1PO 2 0.09（2/2159） 1 1 Penta D 2 0.09（2/2159） 1 1 D10S1248 2 0.09（2/2159） 2 D19S433 1 0.05（1/2159） 1 vWA 4 0.19（4/2159） 1 1 2 D21S11 1 0.05（1/2159） 1 D18S51 1 0.05（1/2159） 1 D6S1043 2 0.09（2/2159） 2 D8S1179 4 0.19（4/2159） 2 2 D5S818 1 0.05（1/2159） 1 D12S391 6 0.28（6/2159） 2 2 1 1 FGA 9 0.42（9/2159） 3 3 3合計 53 2.45（53/2159） 22 14 13 1 2 1

2.2 突變步數(shù)

STR基因座突變步數(shù)在52例突變案例中，共觀察到53次突變，其中一步突變49次（92.45%），二步突變1次（1.89%），三步突變3次（5.66%）。一步突變現(xiàn)象里減少1個重復單位（-1）有12次，增加1個重復單位（+1）有22次，不確定是增加或者減少1個重復單位的13次；兩步突變現(xiàn)象為減少2個（-2）重復單位；三步突變分別為2個（+3）和1個（-3）重復單位。突變等位基因的步數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（x2=126.423，P＜0.001）。

2.3 突變來源

在觀察到的53次突變中，50次來源于父系，占94.34%，3次來源于母系，占5.66%，不能確定無。父系來源突變與母系來源突變的比例約16.67:1，差異有統(tǒng)計學意義（x2=83.358，P＜0.001）。

3 討 論

3.1 STR基因座的突變率分析

研究STR基因座的突變率應(yīng)該至少要觀察500次細胞減數(shù)分裂[12]。本文采用AGCU EX22 kit檢測并統(tǒng)計了1596例支持存在親權(quán)關(guān)系的案例。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有2159次減數(shù)分裂，其中有20個基因座存在基因突變現(xiàn)象，突變率在0.05%～0.42%之間，略高于美國血庫協(xié)會2008年公布的年度數(shù)據(jù)。針對基因座的結(jié)構(gòu)和重復序列中核心序列的重復次數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)突變率可能與基因座的多態(tài)性及片段長度有關(guān)。如核心序列重復次數(shù)大于10次的FGA、Penta E、vWA、D8S1179基因座突變率較高。通常應(yīng)用于親權(quán)鑒定的遺傳標記STR的總突變率應(yīng)不高于0.2%。本研究中FGA、Penta E、D12S391基因座的總突變率大于0.2%，因此在法醫(yī)物證檢案中應(yīng)注意突變問題，必要時采取其他手段輔助鑒定以降低誤判風險。此外，本次研究顯示三聯(lián)體的突變率是5.33%（30/563），二聯(lián)體的突變率是2.13%（22/1033），三聯(lián)體的突變率明顯高于二聯(lián)體，發(fā)生此情況的原因可能是二聯(lián)體少了父親或母親一方的遺傳信息，部分突變案例沒能被發(fā)現(xiàn)。

3.2 STR基因座的突變機制及模式分析

STR基因座突變機制認為主要由于復制滑動或復制滑鏈錯配引起。常用的STR基因座突變率在0.1%～0.5%。STR基因座的突變表現(xiàn)為重復單位數(shù)目的改變，主要分為兩類：一步突變和多步突變[13-14]。串聯(lián)排列的正向重復序列以及重復次數(shù)較多的序列中發(fā)生復制滑鏈錯配的概率較大，突變率也相應(yīng)較大。步數(shù)越少，發(fā)生突變的概率相對較大。另外一步突變可通過累積發(fā)生多步突變。STR基因座主要是以逐步突變模式發(fā)生，以單個重復單位的增減為主，占90%以上，兩個或者更多重復單位改變較少見。本研究結(jié)果顯示一步突變率為92.45%，明顯高于二步和三步突變，與先前所報道的結(jié)果一致[15]。

3.3 STR基因座突變與性別、年齡

據(jù)李秋陽等報道，性別差異在突變現(xiàn)象中較明顯，男性于女性發(fā)生突變的比例為8:1，此外突變與父親年齡相關(guān)，突變率隨父親的年齡的增加也有增加趨勢[16]。本研究顯示父系與母系來源的突變存在顯著的性別差異（比例為16.67:1），這和李秋陽等報道的結(jié)果一致。發(fā)生顯著差異的原因可能是在男性精母細胞逐步分裂成精子的過程中，細胞需要的分裂次數(shù)比女性配子細胞成熟需要分裂的次數(shù)要多得多，所以產(chǎn)生突變的概率變大。本文觀察到50例STR基因座突變來源于父親，他們生育小孩的年齡最小25歲，最大54歲。

3.4 STR基因座突變的應(yīng)對

在親權(quán)鑒定案件中，按照司法部《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（SF/ZJD0105001-2016）要求，鑒定中遺傳標記累計非父排除率均應(yīng)不小于0.9999，計算CPI＞10000視為支持存在親權(quán)關(guān)系；CPI＜0.0001，則排除存在親權(quán)關(guān)系。如果0.0001＜CPI＜10000，應(yīng)通過增加檢測的遺傳標記來達到要求。本文用AGCU EX22 kit常規(guī)檢測22個STR基因座，若所測基因座符合遺傳規(guī)律，CPI＞10000，則支持存在親權(quán)關(guān)系（1596例）。由于STR基因座在遺傳過程中會產(chǎn)生突變，本研究在出現(xiàn)1～2個STR基因座不符合遺傳規(guī)律加測了AGCU 21+1 kit。如果增測后沒有發(fā)現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的基因座，計算CPI 大于 10000，我們認為該STR基因座發(fā)生了突變（52例）。如果涉及的STR基因座突變案件中該STR基因座檢測結(jié)果為純合子時，我們會用IdentitiflerTM試劑盒對該樣本重新檢測，防止發(fā)生等位基因丟失（Null allele）而導致假突變現(xiàn)象。本研究中發(fā)現(xiàn)的52個突變案件，均檢測了40個STR基因座，其中發(fā)現(xiàn)的STR基因座不符合孟德爾遺傳規(guī)律均可能是在遺傳過程中STR基因座發(fā)生突變所引起。我們后續(xù)將通過測序證實突變的來源，進一步對突變家系進行研究。