王建勛,孫丕云,周金龍,張淑巖△

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

缺血引起的腦細(xì)胞死亡始于神經(jīng)元興奮性毒性[1-2]。引起神經(jīng)元興奮性毒性的機制包括谷氨酸轉(zhuǎn)運體的功能障礙[3]以及谷氨酸依賴的細(xì)胞內(nèi)Ca2+和自由基增加[4-5]。針對上述機制的治療方法對缺血性卒中并沒有顯著療效[6]。因此需要探索缺血性卒中的其他機制和治療策略。

缺血后γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)能神經(jīng)元功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞的興奮性和抑制性之間失去平衡，這可能是產(chǎn)生神經(jīng)元興奮性毒性的機制之一[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)針刺百會和足三里等穴位能明顯改善缺血性卒中患者的預(yù)后[8-9]。本研究旨在探討針刺穴位改善腦卒中預(yù)后的機制是否與針灸保護(hù)大腦皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元功能有關(guān)。通過皮質(zhì)腦片的全細(xì)胞記錄，筆者發(fā)現(xiàn)針灸可以改善GABA能神經(jīng)元缺血后的動作電位編碼能力下降和突觸傳遞功能障礙。

1　材料和方法

1.1　藥品及試劑

NaCl：sigma公司;KCl：sigma公司;NaH2PO4：sigma公司;CaCl2：sigma公司;MgSO4：sigma公司;dextrose：sigma公司;HEPES：sigma公司;KOH：sigma公司;EGTA：sigma公司;Mg2+-ATP：sigma公司;Tris-GTP：sigma公司;葡萄糖酸鉀：sigma公司;95% O2和 5% CO2：合肥巨網(wǎng)氣體有限公司;NaOH:sigma公司。

1.2　實驗動物

選擇FVB-Tg(Gad GFP)4570Swn/J轉(zhuǎn)基因小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME 04609,USA)，該小鼠是將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因插入小鼠谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)基因下游，使GFP與GAD同時表達(dá)。該小鼠大腦皮層GABA能神經(jīng)元在熒光顯微鏡藍(lán)光(波長488nm)的激發(fā)下，在高倍鏡鏡下可觀察到該種神經(jīng)元發(fā)出綠色熒光，以此與其他神經(jīng)元相鑒別，為皮層GABA能神經(jīng)元的正確選擇提供保障。

1.3　實驗分組

本實驗分為3組： 缺血組、缺血加針灸組及對照組。

1.3.1缺血組小鼠出生后第20天處死，取腦制備皮質(zhì)腦片，并建立體外缺血模型，全血細(xì)胞記錄觀察動作電位變化情況。

1.3.2缺血加針灸組針灸部位選擇百會穴，穴位位于顱頂正中，冠狀縫和矢狀縫的交匯處。小鼠出生后的第13天給予穴位電刺激，兩人配合操作，一人抓取活體小鼠以固定，另一人以0.25 mm×25 mm毫針向百會穴平刺約3 mm，每日兩次，10 min捻轉(zhuǎn)1次，平補平瀉，捻轉(zhuǎn)1 min，每次針刺持續(xù)20 min，連續(xù)刺激7天。連續(xù)1周。隨后處死小鼠，取腦制備皮質(zhì)腦片,并建立體外缺血模型，全血細(xì)胞記錄觀察動作電位變化情況。

1.3.3對照組小鼠出生后第20天處死，取腦制備皮質(zhì)腦片，全血細(xì)胞記錄觀察動作電位變化情況。

1.4　腦片和神經(jīng)元

3組實驗小鼠于第20天吸入異氟烷麻醉，閘刀斷頭，振動切片機于4℃充分氧和(95% O2和5% CO2)的低鈣人工腦脊液(Artificial Cerebrospinal Fluid，ACSF)中切出皮質(zhì)腦片。腦片厚度為400 μm。低鈣ACSF成分(mM)：124 NaCl,3 KCl,1.2 NaH2PO4,26NaHCO3,0.5 CaCl2,4 MgSO4,10 dextrose,5 HEPES,pH 7.35。腦片于25℃氧和ACSF中孵育1～2 h，ACSF成分(mM)：124 NaCl,3 KCl,1.2 NaH2PO4,26NaHCO3,2.4 CaCl2,1.3 MgSO4,10 dextrose,5 HEPES,pH 7.35。氧和ACSF灌流全浸式記錄浴槽，腦片移至其中并在31℃下進(jìn)行全細(xì)胞記錄[10]?；瘜W(xué)試劑均購自Sigma。本實驗得到黑龍江省哈爾濱市實驗動物管理與使用委員會(IACUC)的批準(zhǔn)。

選擇位于感覺皮質(zhì)II～I(xiàn)II層的皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞記錄。GFP標(biāo)記的GABA能神經(jīng)元在熒光顯微鏡(Nikon，F(xiàn)NE600)488 nm波長激發(fā)下呈現(xiàn)綠色熒光。

1.5　全細(xì)胞記錄

皮質(zhì)GABA能神經(jīng)全細(xì)胞記錄采用AxoPatch-200B放大器。神經(jīng)元動作電位的記錄模式為電流鉗，突觸后電流的記錄模式為電壓鉗。由pClamp 10軟件 (Axon Instrument Inc.,Foster CA,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。放大器的輸出帶寬為3 kHz。全細(xì)胞記錄電極內(nèi)液成分為(mM)：150 K-gluconate,5 NaCl,5 HEPES,0.4 EGTA,4 Mg-ATP,0.5 Tris-GTP,and 5 phosphocreatine (2M KOH調(diào)pH為7.35)。電極內(nèi)液由濾器(0.1 μm)過濾后實驗當(dāng)日使用，滲透壓為295～305 mOsmol。電極電阻為5～6 mΩ。

觀察GABA能神經(jīng)元的內(nèi)在特性以及對興奮性突觸傳遞的反應(yīng)，以評價GABA能神經(jīng)元的功能。去極化電流刺激誘發(fā)出GABA能神經(jīng)元的動作電位。依據(jù)實驗?zāi)康脑O(shè)置刺激強度及持續(xù)時間。GABA能神經(jīng)元的突觸反應(yīng)由興奮性突觸傳遞介導(dǎo)。

本研究的GABA能細(xì)胞內(nèi)在特性包括動作電位的閾電位(Threshold Potentia，Vts)和絕對不應(yīng)期(Absolute Refractory Period,ARP)。Vts是誘發(fā)動作電位時的電壓,測量ARP時，向細(xì)胞內(nèi)輸入多個3 ms去極化電流刺激，后一個刺激緊接著前一個動作電位之后見圖3。通過改變刺激間期，將ARP規(guī)定為1個完整動作電位后出現(xiàn)下個動作電位概率為50%的兩動作電位之間的時程。此外，群集動作電位鋒間距(Inter-spike intervals,ISI)表示動作電位的發(fā)放容量[11]。群集動作電位由200 ms去極化刺激誘發(fā)，刺激強度為引發(fā)每個細(xì)胞單個動作電位的閾刺激(10 ms)。

在皮質(zhì)腦片GFP標(biāo)記的GABA能神經(jīng)元上記錄自發(fā)興奮性突觸后電流(Spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs)，用來反映GABA能神經(jīng)元接收其他細(xì)胞突觸傳遞的能力。sEPSC的幅度表示GABA能神經(jīng)元對突觸前傳遞的反應(yīng)強度，事件間期(inter-event intervals)表示GABA能神經(jīng)元的突觸活性。

1.6　體外缺血模型

通過減慢灌流速度(從2 mL/min到0.2 mL/min，持續(xù)6 min)以模擬缺血性腦卒中的動脈阻塞和側(cè)支循環(huán)。減慢灌流速度2 min后測量動作電位內(nèi)在特性和興奮性突觸反應(yīng)，靜息膜電位明顯下降之前恢復(fù)正常灌流速度[12]。

2　結(jié)果

2.1　針灸對缺血后皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元動作電位編碼損傷的保護(hù)作用

圖1表示缺血組與缺血加針灸組GABA能細(xì)胞群集動作電位的變化。與對照組(見圖1A)相比，缺血(見圖1B)減弱動作電位編碼。而與缺血組(見圖1B)相比，針刺百會穴能改善缺血后動作電位損傷(見圖1C)。1～2鋒間到4～5鋒間的ISI值，對照組分別為7.8±0.29、9.1±0.32、10.12±0.38以及(10.78±0.41)ms(見圖1A,n=32)，缺血組分別為11.34±0.58、12.79±0.72、14.1±0.78以及(15±0.9)ms(圖1B，n=15)，缺血加針灸組分別為8.25±0.5、10.1±0.63、11±0.67以及11.6±0.59(圖1C，n=17)。對照組與缺血組、缺血組與缺血加針灸組，相應(yīng)鋒間的ISI值具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。針刺百會穴對缺血后皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元動作電位編碼的損傷具有保護(hù)作用。GABA能神經(jīng)元的群集動作電位由去極化刺激(200 ms)誘發(fā)。

2.2　針灸拮抗缺血后閾電位的升高和不應(yīng)期的延長

圖2～3表示缺血和針刺百會穴對皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元Vts和ARPs的影響。對照組、缺血組和缺血加針灸組閾電位的比較見圖2。對照組閾電位為(22.1±0.79)mV(A，n=32)，缺血組為(27.1±0.9)mV(B，n=15)，缺血加針灸組為(23.1±0.78)mV(C,n=17)。統(tǒng)計分析表明，缺血組和對照組以及缺血組和缺血加針灸組之間比較，閾電位有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。因此，缺血影響皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元激發(fā)群集動作電位，針刺百會穴能拮抗缺血的作用。

對照組、缺血組和缺血加針灸組動作電位不應(yīng)期的比較見圖3。缺血能延長動作電位不應(yīng)期，針灸能拮抗缺血的作用。對照組不應(yīng)期的值為(4.13±0.07)ms(A,n=32)，缺血組為(4.82±0.15)ms(B，n=15)，缺血加針灸組為(4.18±0.198)ms(C,n=17)。統(tǒng)計分析表明，缺血組和對照組以及缺血組和缺血加針灸組之間比較，不應(yīng)期有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。因此，缺血致使皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元動作電位不應(yīng)期延長，針刺百會穴能拮抗缺血的作用。

圖2　針灸拮抗皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元缺血后閾電位的升高　　注:閾電位(ΔV)是閾值電壓(Vts)和靜息膜電位(Vr)之間的差值;A對照組、B缺血組、C缺血加針灸組閾電位;與缺血組比較,**P<0.01;對照組n=32,缺血組n=15，缺血加針灸組n=17

圖3　針灸拮抗皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元缺血后動作電位不應(yīng)期的延長　　注:A對照組、B缺血組、C缺血加針灸組動作電位不應(yīng)期;與缺血組比較,**P<0.01;對照組n=32,缺血組n=15,缺血加針灸組n=17

2.3　針灸對缺血后皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元突觸反應(yīng)損傷的保護(hù)作用

缺血和針灸對興奮性突觸傳遞的影響見封三彩圖4。缺血大幅降低sEPSC的幅度和頻率(封三彩圖4A左與中)，針刺百會穴能拮抗缺血的作用(封三彩圖4A中與右)。封三彩圖4B表示對照組(紅色)、缺血組(藍(lán)色)和缺血加針灸組(綠色)的累積概率與sEPSC幅值曲線，封三彩圖4C表示累積概率與事件間期曲線。缺血組和對照組以及缺血組和缺血加針灸組之間比較，sEPSC的幅度和頻率有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01，n=10)。因此，針刺百會穴對皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元興奮性突觸傳遞的缺血后損傷具有保護(hù)作用。

3　討論

全細(xì)胞電流鉗模式下，記錄缺血加針灸組與對照組小鼠皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元的群集動作電位。群集動作電位由去極化刺激誘發(fā)。動作電位鋒間距(Inter-spike intervals,ISI)表示動作電位的發(fā)放容量[13]。

受電壓門控鈉通道調(diào)控的閾電位和不應(yīng)期，控制著動作電位參數(shù)[14]。既往研究表明，針灸對動作電位編碼缺血后損傷的保護(hù)作用可能與針灸減弱缺血對閾電位和不應(yīng)期的影響有關(guān)[15]。為此筆者檢測了不同條件下(實驗方法)ARPs及Vts的改變。

筆者不僅研究了皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元的動作電位編碼，還觀測了GABA能神經(jīng)元的另一功能，即其對突觸前皮質(zhì)神經(jīng)元突觸輸入的反應(yīng)能力。在皮質(zhì)腦片GFP標(biāo)記的GABA能神經(jīng)元上記錄自發(fā)興奮性突觸后電流(sEPSCs)。sEPSC的幅度表示GABA能神經(jīng)元對突觸前傳遞的反應(yīng)強度，事件間期(inter-event intervals)表示GABA能神經(jīng)元的突觸活性。

本研究表明，缺血損傷皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元的功能，包括損傷動作電位編碼以及興奮性突觸傳遞，而針刺百會穴對皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元功能的缺血后損傷具有保護(hù)作用。動作電位的閾電位和不應(yīng)期由電壓門控鈉通道控制，缺血及針灸以此為靶點影響動作電位編碼。針刺百會穴改善卒中預(yù)后[16-17]的機制包括：保護(hù)皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元的功能，興奮和抑制的再平衡以及減少缺血后神經(jīng)元的興奮性毒性損傷。

抗凝、溶栓和細(xì)胞保護(hù)藥物并不能明顯改善卒中患者的預(yù)后[18]。已經(jīng)表明，針刺某些腧穴可以改善缺血性卒中的預(yù)后[19-20]，因此穴位刺激可能是治療缺血性卒中的另一種方法。筆者發(fā)現(xiàn)改善皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元缺血后的功能障礙以及降低神經(jīng)興奮性毒性，是針灸減輕缺血損傷的機制之一。

最近的研究表明，針灸減少缺血損傷的機制與針灸促使GABA能神經(jīng)元標(biāo)記物γ-氨基丁酸、鈣結(jié)合蛋白和神經(jīng)肽Y表達(dá)增加有關(guān)[21]。并且本研究發(fā)現(xiàn)針刺百會穴可增強GABA能神經(jīng)元抵抗缺血性損傷的能力，因此挽救或增加GABA的功能是缺血性卒中的有效治療方法，可防止缺血性卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞凋亡和壞死，促進(jìn)神經(jīng)元再生。

就針灸作用的分子靶點而言，針刺穴位下調(diào)caspase-3、核因子-κB和環(huán)氧合酶的表達(dá)[22]，同時上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞生長因子[23]，從而降低了腦組織的缺血性損傷。因此，針灸通過多種信號傳導(dǎo)途徑，防止缺血性卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞凋亡和壞死，促進(jìn)神經(jīng)元再生。