湯國軍，胡叢崗，童骎，姚葉鋒，楊偉東

（1. 浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院 胃腸外科，浙江 金華 321000；2. 寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院，麻醉科 浙江 鄞州 315100）

結(jié)直腸癌的治療方式主要以手術治療為主，術后輔助放化療及免疫治療等，隨著手術方式的改進、放射治療及化療藥物種類的增多，及免疫治療藥物的研發(fā)，使結(jié)直腸癌的治療取得巨大進步[1-2]，但由于結(jié)直腸癌缺乏有效的早期診斷指標，使多數(shù)結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)時已為結(jié)直腸癌晚期，錯過了手術時機，預后比較差；對于結(jié)直腸晚期患者的治療主要依賴分子靶向藥物治療和細胞因子制劑治療[3-4]，但結(jié)直腸癌的5年生存率仍比較低， 因此研究結(jié)直腸癌發(fā)病過程中的關鍵性分析對結(jié)直腸癌患者的診治及開發(fā)新的分子靶向藥物具有重要意義。程序性死亡配體1（PD-L1）在免疫耐受方面發(fā)揮重要作用，在多種惡性腫瘤中異常表達，和多種惡性腫瘤的預后和惡性程度有關[5-8]。本文對結(jié)直腸癌組織中PD-L1的表達情況及其對結(jié)直腸癌細胞生長的影響進行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床標本與細胞株

收集浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院胃腸外科病理證實的結(jié)直腸癌標本100例、癌旁組織標本100例、結(jié)直腸腺瘤標本100例和正常結(jié)直腸組織標本100例，所有標本均經(jīng)病理證實。排除標準：患其它部位原發(fā)惡性腫瘤者，消化道相關淋巴瘤者，手術前進行過放療或化療者，拒絕參與研究者。所有研究對象簽署知情同意書，經(jīng)浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批。人結(jié)腸癌HCT116細胞株購自美國ATCC公司；兔抗人PD-L1單克隆抗體、免疫組化染色試劑盒購自英國ABCAM公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化檢測 將上述結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、癌旁組織和正常結(jié)直腸組織標本進行石蠟包埋，經(jīng)石蠟切片標本采用免疫組織化學SP法測定各結(jié)直腸組織中PD-L1含量，一抗為兔抗人PD-L1單克隆抗體，陰性對照一抗以PBS液代替，細胞膜上出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色染色為PD-L1陽性細胞。

1.2.2 PD-L1干擾載體制備 由上海吉瑪公司設計和合成PD-L1 siRNA，并設計與人類基因沒有同源性的siRNA作為陰性對照序列。

1.2.3 實驗分組 將HCT116細胞分為3組：PDL1 siRNA組（轉(zhuǎn)染PD-L1 siRNA）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）、空白對照組（不進行轉(zhuǎn)染）。

1.2.4 結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)染 取生長良好的結(jié)直腸癌細胞接種到6孔板中，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞達80%左右融合時進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行干擾效率檢測。

1.2.5 細胞PD-L1蛋白的表達檢測 采用Western blot法測定各組結(jié)直腸癌細胞中PD-L1蛋白的表達情況：提取各組結(jié)直腸癌細胞總蛋白質(zhì)，進行蛋白電泳，對實驗條帶進行拍照觀察，采用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照計算各組細胞中PD-L1蛋白的相對表達量。

1.2.6 直腸癌細胞增殖檢測 胰蛋白酶消化生長良好的的各組結(jié)直腸癌制成細胞懸液，接種到96孔板中，每組設6個復孔，采用MTT法測定各組結(jié)直腸癌細胞7 d內(nèi)的生長情況，酶標儀測定波長490 nm處吸光度值，結(jié)直腸癌細胞的增殖情況以波長490 nm處的吸光度值表示。

圖1 PD-L1免疫組化染色（×200） A：結(jié)直腸癌組織中PD-L1陽性表達；B：結(jié)直腸腺瘤組織中PD-L1陽性表達；C：癌旁組織中PD-L1陽性表達；D：正常結(jié)直腸組織中PD-L1陰性表達

1.2.7 細胞凋亡檢測 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，進行Annexin V/PI雙染色，采用流式細胞術法測定各組結(jié)直腸癌細胞凋亡情況。

1.2.8 細胞侵襲能力檢測 將各組結(jié)直腸癌細胞接種到6孔板中培養(yǎng)24 h，進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，采用Transwell法測定各組細胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行分析，率的比較采用χ2檢驗，均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PD-L1在結(jié)直腸癌組織中的表達情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，PD-L1在結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織、癌旁組織、正常結(jié)直腸組織中的陽性表達率分別為45.0%、33.0%、10.0%、0，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）（表1）。

表1 各組標本中PD-L1的陽性表達率[n=100，n（%）]

圖2 Western blot檢測結(jié)果 A：各組PD-L1表達水平；B：siRNA PD-L1轉(zhuǎn)染后不同時間

2.2 siRNA PD-L1對結(jié)直腸癌細胞中PD-L1的干擾效率

Western blot檢測siRNA PD-L1對HCT116細胞中PD-L1的干擾效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：siRNA PD-L1轉(zhuǎn)染后HCT116細胞中PD-L1的表達明顯降低，轉(zhuǎn)染后2 d對HCT116細胞中PD-L1的干擾效率最高（圖2）。

2.3 siRNA PD-L1對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響

各組細胞第1天OD值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第3、7天，siRNA PD-L1組結(jié)直腸癌細胞OD值低于陰性對照組和空白對照組（均P＜0.05），陰性對照組和空白對照組結(jié)直腸癌細胞各時間點OD值比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（表2）。

表2 各組結(jié)直腸癌細胞OD值比較（±s）

表2 各組結(jié)直腸癌細胞OD值比較（±s）

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與陰性對照組比較，P＜0.05

組別 第1天 第3天 第7天空白對照組 0.513±0.121 1.585±0.194 2.416±0.231陰性對照組 0.505±0.114 1.523±0.187 2.321±0.232 siRNA PD-L1 組 0.497±0.102 1.242±0.1781), 2)1.532±0.1921), 2)F 0.325 4.636 30.245 P 0.921 0.021 0.000

2.4 siRNA PD-L1對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響

siRNA PD-L1組細胞凋亡率高于陰性對照組和空白對照組（均P＜0.05），陰性對照組和空白對照組凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

2.5 siRNA PD-L1對結(jié)直腸癌細胞侵襲能力的影響

siRNA PD-L1組侵襲細胞數(shù)低于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05），陰性對照組和空白對照組侵襲細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表4）。

表3 各組結(jié)直腸癌細胞凋亡率（%，±s）

表3 各組結(jié)直腸癌細胞凋亡率（%，±s）

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與陰性對照組比較，P＜0.05

組別 細胞凋亡率空白對照組 0.98±0.04陰性對照組 1.03±0.03 siRNA PD-L1 組 15.46±5.31), 2)F 63.142 P 0.000

表4 各組結(jié)直腸癌細胞侵襲細胞數(shù)（個，±s）

表4 各組結(jié)直腸癌細胞侵襲細胞數(shù)（個，±s）

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與陰性對照組比較，P＜0.05

組別 細胞侵襲細胞數(shù)空白對照組 236.47±18.21陰性對照組 225.35±17.58 siRNA PD-L1 組 112.43±12.641), 2)F 125.47 P 0.000

3 討 論

3.1 PD-L1在結(jié)直腸癌中的表達情況

PD-L1是B7家族成員，是程序性死亡分子1的配體，在巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞和T細胞中廣泛表達，PD-L1在上述細胞上的表達受到干擾素-γ的刺激后進一步升高[9-11]；提呈抗原細胞表面的PD-L1分子和T細胞表面的程序性死亡分子-1結(jié)合發(fā)揮作用[9-10]，在免疫耐受的誘導和維持方面具有重要作用[11-14]；PD-L1在多種惡性腫瘤細胞中也有異常表達[15-16]，和惡性腫瘤細胞的預后和惡性程度有關，和腫瘤浸潤淋巴細胞關系密切，PD-L1和腫瘤浸潤淋巴細胞表達的程序性死亡分子1結(jié)合，從而對腫瘤浸潤淋巴細胞的功能產(chǎn)生抑制作用，導致腫瘤免疫逃逸[17-19]。沈吟芳等[20]研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中PD-L1表達顯著升高，調(diào)節(jié)性T細胞浸潤也明顯升高，肺癌組織中PD-L1水平和調(diào)節(jié)性T細胞浸潤為正相關關系，梁姣姣等[21]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌調(diào)節(jié)性T細胞上的PD-L1表達升高，調(diào)節(jié)性T細胞和PD-L1的升高可能是促進結(jié)腸癌免疫逃逸得重要因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PD-L1在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌旁組織細胞胞漿和胞膜中有表達，在正常結(jié)直腸組織中無PD-L1表達。結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸腺瘤組織中PD-L1陽性表達率高于正常結(jié)直腸組織，結(jié)直腸癌組織中PD-L1陽性表達率高于結(jié)直腸腺瘤組織，但差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)直腸腺瘤被認為是結(jié)直腸癌的癌前病變，結(jié)直腸癌的發(fā)生經(jīng)過結(jié)直腸腺瘤期，考慮PD-L1陽性在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

3.2 PD-L1對結(jié)直腸癌細胞生長的影響

本研究發(fā)現(xiàn)：siRNA PD-L1轉(zhuǎn)染后可降低結(jié)直腸癌細胞中PD-L1的表達，轉(zhuǎn)染后2 d對HCT116細胞中PD-L1的干擾效率最高；第3、7天，siRNA PD-L1組細胞OD值低于陰性對照組和空白對照組；siRNA PD-L1組細胞凋亡率高于陰性對照組和空白對照組；siRNA PD-L1組侵襲細胞數(shù)低于陰性對照組和空白對照組，表明下調(diào)HCT116細胞中的PD-L1水平，可以抑制HCT116細胞的增殖，促進結(jié)凋亡，抑制癌細胞的侵襲能力。在結(jié)直腸癌組織中，PD-L1呈高表達，PD-L1水平的升高可能通過促進結(jié)直腸癌細胞增殖，抑制結(jié)直腸癌細胞凋亡，增加結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力發(fā)揮促進結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用。PD-L1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能不只作為程序性死亡分子1的配體，還可能抑制受體傳遞信號的作用，對腫瘤浸潤T細胞的殺傷功能產(chǎn)生抑制，增加腫瘤細胞的惡性程度。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中PD-L1水平升高，下調(diào)結(jié)直腸癌細胞中PD-L1的表達水平可以對結(jié)直腸癌細胞的生理功能產(chǎn)生影響，使結(jié)直腸癌細胞的惡性程度降低。

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