張路贏，馬丹霞，楊艾堂，彭會(huì)明

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見的中樞性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是一種由多基因和多因素影響的神經(jīng)性疾病，但具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。AD患者主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、語言障礙、記憶障礙和人格改變等，嚴(yán)重影響患者的社交和生活質(zhì)量[2]，因此，探究有效治療AD的藥物是神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生研究的重點(diǎn)。血竭素是從血竭中提取的，其主要有效成分是黃酮類物質(zhì)[3]，具有抗菌消炎、活血生肌、收斂止血的功效[4]，近年來研究表明，炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5]，而且血竭素高氯酸鹽對(duì)AD的療效尚未見報(bào)道。本研究以阿爾茨海默病模型大鼠為研究對(duì)象，探究血竭素高氯酸鹽對(duì)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)通路相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 健康雄性SD大鼠70只，SPF級(jí)，6～8周齡，體重(150±20)g，購(gòu)自北京生命科學(xué)研究所，許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0002。

1.1.2 主要材料與儀器 血竭素高氯酸鹽(純度為99.2%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；多奈哌齊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20050978)購(gòu)自衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司；TRIzol reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物(大連)有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自英國(guó)NEB公司；兔抗鼠Aβ、TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；3K15超低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；超凈臺(tái)購(gòu)自上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；引物序列由深圳華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 阿爾茨海默病動(dòng)物模型建立 隨機(jī)選取10只大鼠作為假手術(shù)組，其余大鼠按照文獻(xiàn)資料構(gòu)建AD模型[6]，具體操作如下，將大鼠稱重，腹腔注射4%水合氯醛進(jìn)行麻醉，頭部剪毛消毒，將大鼠固定于腦立體定位儀上，于頭皮正中切開，剝離右側(cè)顱頂骨膜，用顱骨鉆刺一2 mm的骨窗，剝開硬腦膜，用微量注射器向大鼠大腦海馬區(qū)注入5 μl Aβ1-42磷酸鹽溶液(注射速度1 μl/min)；假手術(shù)組以相同方法注射等量磷酸緩沖液，手術(shù)后均用牙科水泥固定骨孔處，干燥后縫合頭皮，給大鼠腹腔注射120 000 U/kg，將大鼠回籠飼養(yǎng)48 h(排除手術(shù)和麻醉干擾)。

1.2.2 動(dòng)物分組 將造模成功的大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，分別命名為模型組、多奈哌齊組、DP低劑量組、DP中劑量組、DP高劑量組，多奈哌齊組給予0.33 mg/kg多奈哌齊，DP組按低、中、高劑量分別給予10、20、30 mg/kg DP，所有大鼠均行灌胃治療，假手術(shù)組及模型組給予等量容積生理鹽水，持續(xù)治療4周。

1.2.3 六組大鼠水迷宮(Morris water maze，MWM)實(shí)驗(yàn) 持續(xù)治療4周后，采用MWM實(shí)驗(yàn)檢測(cè)六組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力：①學(xué)習(xí)訓(xùn)練：將大鼠分別從4個(gè)象限放入水中，記錄其在2 min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(s)，連續(xù)訓(xùn)練5 d，保證每只大鼠每天訓(xùn)練次數(shù)相同；②定位航行實(shí)驗(yàn)：在MWM實(shí)驗(yàn)的第5天，將大鼠從某一固定的象限放入水中，記錄其找到平臺(tái)的時(shí)間(s)，即為逃避潛伏時(shí)間，超過2 min的即為2 min，連續(xù)測(cè)試4 d，保證每天大鼠的入水順序不同；③空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤走安全平臺(tái)，將大鼠從放置平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中，記錄大鼠2 min內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)(即為探索次數(shù))。

1.2.4 六組大鼠腦組織分離 按照“1.2.1”項(xiàng)中的方法將大鼠麻醉，酒精消毒后，在無菌的超凈臺(tái)剪開大鼠胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛灌注固定，直至肝臟變白、四肢僵硬，斷頭后剪開頭皮及顱骨，取出全腦，在體視顯微鏡下去除腦膜及血管后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)六組大鼠海馬組織中Aβ mRNA表達(dá)水平 取六組大鼠海馬區(qū)域組織，用TRIzol reagent提取其總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)成cDNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)Aβ的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR。PCR的反應(yīng)體系：5×緩沖液10 μl，TaqDNA聚合酶1 μl，上游引物F2 μl，下游引物R 2 μl，10 mmol dNTP mix 1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 33 μl；PCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：62 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。采用最大二階導(dǎo)數(shù)法(2-△△Ct)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算Aβ的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 免疫組化染色檢測(cè)六組大鼠海馬組織中Aβ的表達(dá)水平 取六組大鼠海馬區(qū)域組織，用冰凍切片機(jī)制作組織切片(不超過5 μm)，將組織切片在92～98 ℃條件下存放20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清中和非特異性反應(yīng)后，在組織玻片上滴加稀釋的兔抗鼠Aβ多克隆抗體，于4 ℃過夜放置，復(fù)溫后滴加二抗，于避光條件下室溫孵育1 h，用甘油封片后，于顯微鏡下觀察六組大鼠海馬組織中Aβ的表達(dá)情況，并采集照片(400×)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)海馬組織中TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表達(dá)水平 取六組大鼠海馬區(qū)域組織，加入2 ml細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣體積20 μl，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，分別滴加兔抗鼠TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2多克隆抗體，置于4 ℃下過夜，滴加二抗后37 ℃放置1 h。加入發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Gel-Pro analyzer4軟件對(duì)SDS-PAGE電泳圖目的條帶進(jìn)行掃描，分析TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)六組大鼠逃避潛伏時(shí)間 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，提示AD模型制備成功。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠逃避潛伏時(shí)間明顯縮短(P<0.05)，且隨DP劑量增加，大鼠逃避潛伏時(shí)間逐漸縮短，呈劑量依賴性。見表1。

2.2 定位探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)六組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù) 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.05)。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯增加(P<0.05)，且呈劑量依賴性，結(jié)果如圖1所示。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)海馬組織中Aβ mRNA表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織中Aβ mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠海馬組織中Aβ mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2。

圖1 六組大鼠定位探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)的次數(shù)

注：A.假手術(shù)組，B.模型組，C.多奈哌齊組，D.DP低劑量組,E.DP中劑量組,F.DP高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

圖2 qRT-PCR檢測(cè)海馬組織中Aβ mRNA表達(dá)水平

注：A.假手術(shù)組，B.模型組，C.多奈哌齊組，D.DP低劑量組,E.DP中劑量組,F.DP高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

2.4 免疫組化染色檢測(cè)六組大鼠海馬組織中Aβ的表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織中Aβ的表達(dá)水平升高。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠海馬組織中Aβ的表達(dá)水平降低，且隨著DP劑量增加，大鼠海馬組織中Aβ的表達(dá)水平逐漸降低見圖3。

2.5 Western blot檢測(cè)海馬組織中TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織中TGF-β1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠海馬組織中TGF-β1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且隨DP劑量增加，大鼠海馬組織中TGF-β1的表達(dá)水平逐漸升高，呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖4、圖5。

表1 六組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏時(shí)間比較(s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量組比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

圖3 免疫組化染色檢測(cè)六組大鼠海馬組織中Aβ的表達(dá)水平(400×)

圖4 Western blot檢測(cè)海馬組織中TGF-β1、SMAD2和p-

注：1.假手術(shù)組，2.模型組，3.多奈哌齊組，4.DP低劑量組，5.DP中劑量組，6.DP高劑量組

圖5 海馬組織中TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量

注：A.假手術(shù)組，B.模型組，C.多奈哌齊組，D.DP低劑量組,E.DP中劑量組,F.DP高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組間SMAD2的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織中p-SMAD2的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠海馬組織中p-SMAD2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且隨DP劑量增加，大鼠海馬組織中p-SMAD2的表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖4、圖6。

圖6 海馬組織中SMAD2和p-SMAD2的相對(duì)表達(dá)水平

注：A.假手術(shù)組，B.模型組，C.多奈哌齊組，D.DP低劑量組,E.DP中劑量組,F.DP高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD屬于老年癡呆的范疇，以細(xì)胞外老年斑(SP)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)和神經(jīng)元丟失為主要的病理改變[7]。大腦皮層和海馬組織中出現(xiàn)大量β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta，Aβ)為其直接的致病原因[8]，因此，本研究采用向大鼠大腦海馬區(qū)注射Aβ1-42磷酸鹽溶液的方法制備AD模型。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏時(shí)間明顯延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯降低，提示AD模型制備成功。

目前，治療AD的藥物主要有扁豆堿、他克林、維吖啶、多奈哌齊和西坦類藥物，這些藥物治療AD有一定療效，但也存在諸多缺點(diǎn)，如藥物安全范圍小、半衰期短，還會(huì)引起哮喘、心臟功能障礙、肝功能異常及消化不良等[9]。近年來研究表明，AD的發(fā)生、發(fā)展與大腦內(nèi)的慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[10]。Pfützner等[11]研究表明，慢性炎癥能夠促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子IL-6。IL-6能夠刺激神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生淀粉樣前體蛋白，進(jìn)而促進(jìn)AD的發(fā)生、發(fā)展。DP的主要有效成分是血竭素，血竭素來源于血竭，具有抗菌消炎、活血生肌的功效。袁慶等[12]研究表明，龍血竭能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，進(jìn)而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子，抑制AD的發(fā)生、發(fā)展。本研究表明，采用DP對(duì)AD大鼠模型治療后，與模型組相比，DP組大鼠逃避潛伏時(shí)間明顯縮短、穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯增加、大鼠海馬組織中Aβ的表達(dá)水平顯著降低，且呈劑量依賴性，結(jié)果提示，DP能夠清除海馬組織中Aβ，進(jìn)而抑制AD的發(fā)生、發(fā)展。

AD是一種多因素相關(guān)的神經(jīng)性疾病，但具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，有研究表明，TGF-β1通路在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著重要作用[13-14]。Chen等[15]在AD模型大鼠腦側(cè)注射TGF-β1，結(jié)果表明，TGF-β1能夠抑制膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而減輕AD模型大鼠神經(jīng)退行性病。SMAD2是TGF-β1下游的信號(hào)分子之一，TGF-β1/SMAD2信號(hào)通路能夠?qū)⒓?xì)胞表面的信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)個(gè)基因的表達(dá)。Ueberham等[16]研究表明，SMAD2在大腦和神經(jīng)的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，而且參與AD的發(fā)生、發(fā)展過程。Song等[17]研究表明，Dab2能夠靶向作用于小鼠的TGF-β1/SMAD2信號(hào)通路，抑制APP/PS1小鼠腦內(nèi)神經(jīng)損傷，進(jìn)而抑制AD的發(fā)生、發(fā)展過程。SMAD2磷酸化后，無法進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致p-SMAD2在細(xì)胞內(nèi)異常聚集，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元纏結(jié)。因此，降低SMAD2的磷酸化水平，有助于抑制AD的發(fā)生發(fā)展。然而DP對(duì)TGF-β1和p-SMAD2蛋白的調(diào)控尚未見報(bào)道。本研究表明，DP能夠上調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平，下調(diào)SMAD2的磷酸化水平，進(jìn)而抑制AD的發(fā)生發(fā)展，且存在劑量依賴關(guān)系。

綜上所述，DP能夠改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶，推測(cè)這一作用是通過調(diào)控海馬組織中TGF-β1和p-SMAD2的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的，為AD的臨床治療提供一定理論基礎(chǔ)。

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