張濤 張偉 王紅平 徐亮 ＊

1 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點試驗室 （北京 100850）

2 四川省食品藥品檢驗檢測院 （四川 成都 611731）

醫(yī)療器械注冊申報中，細胞毒性試驗是重要檢測指標，國內(nèi)參考標準主要是GB/T16886.5-2003和GB/T14233.2-2005。由于標準中規(guī)定的是共性試驗方案，針對具體品種，開展方法學(xué)研究，考察相關(guān)影響因素以確定符合產(chǎn)品特質(zhì)的最適合條件，是產(chǎn)品研發(fā)必要環(huán)節(jié)。

氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠在臨床上廣泛用于傷口粘接、止血等目的。目前有數(shù)個產(chǎn)品上市（如多抹棒、康派特），同時，多項研究也報道了相關(guān)結(jié)構(gòu)設(shè)計和性能優(yōu)化等工作，但不同工作中獲得的細胞毒性結(jié)果差異性較大[1-6]。除單體結(jié)構(gòu)差別外，不同的試驗方法可能是一個重要原因。因此，對氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠的細胞毒性試驗進行方法學(xué)研究，探討相關(guān)影響因素，有助于建立相對統(tǒng)一的認識。此外，探討細胞毒性試驗共性的影響因素，對于更廣范圍的醫(yī)療器械評價也具有參考意義。

本文以氰基丙烯酸正丁酯（504）為例，考察細胞種板數(shù)目、浸提介質(zhì)、浸提條件、細胞與浸提液的培養(yǎng)時間、細胞活性檢測方法等因素對評價結(jié)果的影響，并以此優(yōu)選具體試驗方法。

1.材料與方法

1.1 一般材料

材料：選用本實驗室合成的504；對照材料：陽性對照為含體積分數(shù)0.5%DMSO的生理鹽水溶液；陰性對照為DMEM（含體積分數(shù)10%FBS）細胞培養(yǎng)液。

試劑：DMEM培養(yǎng)基、PBS、青霉素，購自Gibco；二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清（FBS）、四甲基偶氮唑鹽（MTT），購自Sigma；0.9%生理鹽水（石家莊四藥有限公司），0.25%胰蛋白酶(EDTA，Amresco），Cell Counting kit-8試劑盒（CCK-8，博士德生物工程有限公司）。

細胞株：采用GB/T16886.5-2003標準中推薦的傳代2d、生長旺盛的小鼠成纖維細胞L929，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞資源中心提供。

1.2 方法

材料浸提液制備：以0.9%生理鹽水或DMEM為浸提介質(zhì)，質(zhì)量/體積比為0.1g/mL，在37?C、含體積分數(shù)5%CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱中浸提24h或72h，得到的浸提液于24h內(nèi)進行試驗。

細胞毒性試驗及細胞形態(tài)學(xué)觀察：將生長旺盛的L929細胞接種于48孔培養(yǎng)板中并放置于37?C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中24h；加入200μL浸提液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間，觀察細胞生長狀態(tài)并采用MTT或者CCK-8方法檢測細胞相對增殖率。每個樣品重復(fù)3次實驗。

2.結(jié)果

2.1 細胞種板條件

為了在統(tǒng)一條件下進行比較，選用48孔培養(yǎng)板，選取傳代48～72h生長旺盛的L929細胞進行種板，細胞數(shù)設(shè)為1×104個/孔、5×104個/孔、8×104個/孔、1×105個/孔。培養(yǎng)24h后，種板數(shù)目為1×104個/孔細胞密度稍顯稀疏，1×105個/孔則稍顯致密，但四個條件下L929細胞均呈長梭形的正常形態(tài)，貼壁生長良好，無細胞溶解現(xiàn)象，說明細胞生長情況良好，均適合開展進一步的細胞毒性評價試驗。

2.2 細胞種板數(shù)目對細胞毒性試驗結(jié)果的影響

國標GB/T16886.5-2003中未對細胞種板數(shù)量進行規(guī)定，但這一因素可能對細胞毒性試驗結(jié)果產(chǎn)生重要影響。按照2.1中種板數(shù)量進行分組測試，其他試驗條件為：以0.9%生理鹽水為浸提介質(zhì)，浸提條件為37?C、24h。為保持良好的細胞培養(yǎng)液條件，將浸提原液以DMEM進行梯度稀釋后（分為50%組，25%組），再進行細胞培養(yǎng)24h，以MTT法檢測細胞活性。結(jié)果如表1所示。

隨著細胞種板數(shù)目增大，各組中細胞相對增殖率逐漸升高。在顯微鏡下可觀察到，細胞種板數(shù)目8×104個/孔、1×105個/孔的細胞形態(tài)正常、貼壁生長良好、細胞溶解現(xiàn)象較少，而1×104個/孔出現(xiàn)細胞層破壞、呈圓形結(jié)構(gòu)、疏松貼壁、部分細胞溶解的現(xiàn)象。這一結(jié)果說明，細胞種板數(shù)目是細胞毒性試驗的重要影響因素。此外，試驗中也觀察到，隨著浸提液的梯度稀釋，細胞相對增殖率逐漸提高。

2.3 不同浸提介質(zhì)對細胞毒性試驗結(jié)果的影響

國標GB/T16886.5-2003中對材料浸提介質(zhì)的要求是“可使用含血清培養(yǎng)基、不含血清培養(yǎng)基、生理鹽水溶液以及其他適宜的溶劑作為浸提介質(zhì)”。分別選擇生理鹽水、生理鹽水+10%FBS、DMEM為浸提介質(zhì)，其他試驗條件為：細胞種板數(shù)目為1×105個/孔，浸提時間為24h，以MTT為細胞活性檢測方法。結(jié)果如表2所示。

結(jié)果顯示，生理鹽組細胞增殖率高于生理鹽水+10%FBS組和DMEM組，說明浸提介質(zhì)是體外細胞毒性試驗的重要影響因素。DMEM組增殖率較低可能是由于培養(yǎng)基中含有各種氨基酸和葡萄糖等成分，與聚氰基丙烯酸酯材料在溶液條件下發(fā)生相互作用，加速材料降解，從而導(dǎo)致單位時間產(chǎn)生更多副產(chǎn)物如甲醛等。

2.4 不同浸提時間對細胞毒性試驗結(jié)果的影響

國標GB/T16886.5-2003中對浸提時間的要求是“（37±2）?C下不少于24h、（50±2）?C下（72±2）h”。分別選擇37?C條件下24h或者72h，其他條件為：細胞種板數(shù)目為1×105個/孔，以生理鹽水為浸提介質(zhì)，以MTT為細胞活性檢測方法。結(jié)果如表3所示。

在50%浸提稀釋液條件下，浸提24h組的細胞毒性明顯低于浸提72h組，說明浸提時間是細胞毒性試驗的重要影響因素。這可能是由于聚合物會逐漸降解，在較小體積的浸提液條件下，降解產(chǎn)物逐漸累積，尤其是在50%組中，浸提液的降解產(chǎn)物累積達到對細胞毒性的影響較為顯著的程度。

表1. 不同細胞數(shù)目條件下細胞相對增殖率(x±s)

表2. 不同浸提介質(zhì)條件下細胞相對增殖率(x±s)

表3. 不同浸提時間條件下細胞相對增殖率(x±s)

表4. 不同培養(yǎng)時間條件下細胞相對增殖率(x±s)

2.5 細胞在浸提液中不同培養(yǎng)時間對細胞毒性結(jié)果的影響

國標GB/T16886.5-2003要求“浸提液及其浸提稀釋液與細胞培養(yǎng)時間不低于24h”。為了考察細胞與浸提液培養(yǎng)時間對于細胞毒性試驗結(jié)果的影響，分別設(shè)置培養(yǎng)時間為24h或者72h。其他條件為：細胞種板數(shù)目為1×105個/孔，以生理鹽水為浸提介質(zhì)，浸提時間為24h，以MTT為細胞活性檢測方法。試驗結(jié)果如表4所示。

結(jié)果顯示，在各個浸提液濃度梯度條件下，培養(yǎng)24h組的細胞毒性都要低于培養(yǎng)72h組，這說明細胞與浸提液培養(yǎng)時間是細胞毒性試驗結(jié)果的重要影響因素，相關(guān)原因可能與2.4中的情況類似，聚合物的降解片段在細胞培養(yǎng)的時間段內(nèi)進一步降解，并且在較小的體積中持續(xù)對細胞造成毒性。2.6不同檢測方法對細胞毒性試驗結(jié)果的影響

分別采用MTT和CCK-8試劑盒檢測細胞活性，其他條件為：細胞種板數(shù)目為1×105個/孔，以生理鹽水為浸提介質(zhì)，浸提時間為24h，浸提稀釋液加入細胞孔板后培養(yǎng)24h。試驗結(jié)果如表5所示。

結(jié)果顯示，MTT和CCK-8檢測方法得到的細胞毒性試驗結(jié)果存在一定差異，除50%組外，其他兩組CCK-8數(shù)值高于MTT。

3.討論

本文考察了影響氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠細胞毒性試驗的因素。結(jié)果顯示，細胞種板數(shù)目、浸提介質(zhì)、浸提時間、浸提液與細胞培養(yǎng)時間以及檢測方法都是重要影響因素。根據(jù)GB/T16886.5-2003要求及規(guī)定范圍，醫(yī)用膠的細胞毒性試驗方法可以設(shè)置為：將聚合物材料置于37?C、5%CO2培養(yǎng)箱中、以0.9%生理鹽水浸提24h（材料質(zhì)量與浸提介質(zhì)體積比0.1g/mL），將L929細胞（48孔板，1×105個/孔）置于浸提液及其稀釋液中培養(yǎng)24h，采用MTT方法檢測細胞相對增殖率。

表5. 不同細胞活性檢測方法細胞相對增殖率(x±s)

此外，為了使細胞增殖率差異更為明顯，采用了較大的浸提比例，即，按照質(zhì)量/體積比0.1g/mL的方法制備浸提液。但考慮到醫(yī)用膠實際使用后呈高分子膜，按照GB/T 16886.12-2005中要求，還可選擇表面積/體積計算的浸提方法，例如厚度小于0.5mm的情況下浸提比例可為6cm2/mL，換算為質(zhì)量/體積比的值會遠小于本文采用的浸提方案。因此，選擇合理的浸提比例方法也將是重要的影響因素。

需要指出的是，體外細胞毒性試驗條件與體內(nèi)實際情況存在差別：材料在液態(tài)浸提介質(zhì)中的降解速率有別于在人體組織中的降解；孔板中固定量浸提液也有別于體內(nèi)環(huán)境下的體液流動性和可交換性；在孔板中會累積降解產(chǎn)物，而體內(nèi)條件下如果降解產(chǎn)物本身有良好的可代謝性，就能夠快速排出體外而不會因濃度蓄積在局部造成嚴重結(jié)果。因此，對體外細胞毒性試驗的結(jié)果判定中，尤其是諸如可降解生物材料浸提條件選擇時，應(yīng)該謹慎對待。可結(jié)合動物模型和組織病理學(xué)相關(guān)分析來進行全面的毒性判定。再者，試驗細胞的來源和狀態(tài)可能也對結(jié)果有重要影響。

本文探討的這些影響因素在細胞毒性試驗中同樣具有一定共通性，對于更廣泛的醫(yī)療器械評價也具有實際參考意義。

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