葉朝付 寇艷芹 楊笑鶴 甄輝 浙江省醫(yī)療器械審評中心 （浙江 杭州 310012）

總膽固醇是指血液中各脂蛋白所含膽固醇之總和，臨床上主要用于高膽固醇血癥的輔助診斷。影響總膽固醇水平的主要因素有：年齡，性別，飲食習(xí)慣，遺傳因素等。目前，檢測總膽固醇的方法主要包括化學(xué)法、酶法、色譜法、同位素稀釋質(zhì)譜法等，其中膽固醇氧化酶法是現(xiàn)階段臨床應(yīng)用最為廣泛的常規(guī)測定方法。據(jù)不完全統(tǒng)計，國家食品藥品監(jiān)督管理總局目前對外公開已注冊總膽固醇產(chǎn)品信息約150條（含進(jìn)口注冊產(chǎn)品信息），生產(chǎn)企業(yè)覆蓋北京、上海、廣東、浙江、四川等各省市。

該產(chǎn)品已有相應(yīng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1206-2013《總膽固醇測定試劑盒（氧化酶法）》發(fā)布并實施，現(xiàn)結(jié)合YY/T 1206-2013、2016年新修訂版《中國成人血脂異常防治指南》以及省內(nèi)已上市產(chǎn)品情況，對行標(biāo)中線性范圍、空白樣本等未做明確規(guī)定的條款以及準(zhǔn)確度試驗方法與現(xiàn)行其他標(biāo)準(zhǔn)不一致等情況進(jìn)行明確和細(xì)化，并簡要概述膽固醇氧化酶法產(chǎn)品的審評要點，期望能夠為注冊申請人準(zhǔn)備注冊資料提供參考。

1.適用范圍

總膽固醇測定試劑盒是指利用膽固醇氧化酶法對人血清、血漿樣本中總膽固醇含量進(jìn)行體外定量測定的試劑。依據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）、《食品藥品監(jiān)管總局關(guān)于印發(fā)體外診斷試劑分類子目錄的通知》（食藥監(jiān)械管[2013]242號）規(guī)定，該產(chǎn)品屬于第二類體外診斷試劑產(chǎn)品，分類編碼6840。

2.產(chǎn)品命名及檢驗原理

2.1 產(chǎn)品命名

依據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》以及YY/T 1227-2014《臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）命名》的要求，產(chǎn)品名稱規(guī)范表述為“總膽固醇測定試劑盒（CHOD-PAP法）”。

2.2 檢驗原理

標(biāo)本中的膽固醇酯被膽固醇酯酶（CHER）水解為游離膽固醇，與標(biāo)本中存在的游離膽固醇被膽固醇氧化酶（CHOD）氧化為膽甾烯酮和過氧化氫，后者再經(jīng)過氧化物酶（POD）催化，使4-氨基安替比林和酚發(fā)生氧化縮合反應(yīng)，生成紅色醌亞胺（稱Trinder反應(yīng)，或稱PAP反應(yīng)）。標(biāo)本中的膽固醇含量和生成的醌亞胺呈正比，在特定波長檢測醌亞胺的吸光度，對照校準(zhǔn)物即可計算出標(biāo)本中的總膽固醇含量。

3.主要性能指標(biāo)

3.1 試劑空白吸光度

用純化水或生理鹽水等空白樣品加入試劑作為樣品，在試劑盒規(guī)定主波長下測試吸光度值，重復(fù)兩次，均值即為空白吸光度。雙試劑型試劑盒應(yīng)不大于0.080，單試劑型試劑盒應(yīng)不大于0.100。

3.2 線性范圍

線性范圍應(yīng)至少包含2～10mmol/L，線性相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不小于0.990。

3.3 準(zhǔn)確度

試劑盒測試可用于評價常規(guī)方法的國家/國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3次，測試結(jié)果記為（Xi），按公式（1）分別計算相對偏差（B%），如果3次結(jié)果都不超過±10%，即判為合格。如果大于等于2次的結(jié)果不符合，即判為不合格。如果有1次結(jié)果不符合，則應(yīng)重新連續(xù)測試20次，并分別按照公式（1）計算相對偏差，如果大于等于19次測試的結(jié)果都不超過±10%，即判為合格。

式中：Xi為測試結(jié)果；T為國家/國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)示值。

注：目前，國家/國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括GBW09178、GBW 09179、GBW09180、SRM 909c、SRM 1951c等。

3.4 分析靈敏度

試劑盒測試給定濃度的被測物時，吸光度差值（ΔA）應(yīng)符合申請人規(guī)定的范圍。

3.5 精密度

3.5.1批內(nèi)精密度

重復(fù)測試不同濃度（如高、中、低）的質(zhì)控品或樣本10次，CV≤4.0%。

3.5.2批間差

選取3個不同批次的試劑盒，測試不同濃度（如高、中、低）的質(zhì)控品或樣本，每個批號測定3次，試劑盒批間相對極差（R）≤6.0%。

注：應(yīng)注重醫(yī)學(xué)決定水平（6.2mmol/L）附近樣本的選擇。

3.6 穩(wěn)定性

3.6.1效期末穩(wěn)定性

在規(guī)定條件下保存至有效期末進(jìn)行檢驗，其結(jié)果應(yīng)符合要求。

3.6.2加速穩(wěn)定性

根據(jù)試劑盒的有效期，將試劑盒放置于37?C條件下，一定時間（通常是3～7d）后進(jìn)行檢驗，其結(jié)果應(yīng)符合要求。

4.產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、檢驗方法、檢驗結(jié)果的解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。以下簡要說明說明書的相關(guān)要求。

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：總膽固醇測定試劑盒（CHOD-PAP法）。

【包裝規(guī)格】

（1）應(yīng)明確試劑類型，單或雙試劑等。

（2）應(yīng)注明可測試的樣本數(shù)或裝量，如××測試/盒、××mL。

（3）如有貨號，可增加貨號信息。

【預(yù)期用途】

（1）說明試劑盒用于體外定量測定人血清、血漿等樣本中總膽固醇的含量。

（2）明確與總膽固醇測定相關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況。

【檢驗原理】

標(biāo)本中的膽固醇酯被膽固醇酯酶（CHER）水解為游離膽固醇，和標(biāo)本中存在的游離膽固醇被膽固醇氧化酶（CHOD）氧化為膽甾烯酮和過氧化氫，后者再經(jīng)過氧化物酶（POD）催化，使4-氨基安替比林和酚發(fā)生氧化縮合反應(yīng)，生成紅色醌亞胺（稱Trinder反應(yīng)，或稱PAP反應(yīng)）。標(biāo)本中的膽固醇含量和生成的醌亞胺呈正比，在特定左右波長檢測醌亞胺的吸光度，對照校準(zhǔn)物即可計算出標(biāo)本中的總膽固醇含量，其反應(yīng)式如下：

【主要組成成分】

（1）說明試劑盒包含組分的名稱、比例或濃度。

（2）校準(zhǔn)品、質(zhì)控品應(yīng)明確其生物學(xué)來源，校準(zhǔn)品還應(yīng)明確賦值及溯源性，并寫明溯源的最高級別，如量值可溯源至GBW09178、GBW09179、GBW09180或國際參考物質(zhì)SRM 909c、SRM 1951c。

【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性（如適用）、復(fù)溶穩(wěn)定性（如適用）等，標(biāo)明具體的儲存條件、生產(chǎn)日期、使用期限或者失效日期。

【適用儀器】

明確適用儀器的具體型號。

【樣本要求】

應(yīng)明確樣本類型、處理、保存期限及保存條件等，如涉及血漿樣本，應(yīng)明確抗凝劑的要求。

對已知干擾物進(jìn)行說明并明確不產(chǎn)生干擾的最高濃度，如：膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯、抗壞血酸。

【檢驗方法】

詳細(xì)說明試驗操作的各個步驟，包括：

（1）試劑配制方法、注意事項。

（2）試驗條件：反應(yīng)方向、溫度、測定主/副波長、樣本用量、試劑用量、空白/測定讀數(shù)時間等。

（3）校準(zhǔn)：明確配套使用的校準(zhǔn)品及校準(zhǔn)方法。

（4）質(zhì)量控制：明確質(zhì)控品的使用、質(zhì)量控制方法、質(zhì)控頻率。

（5）檢驗結(jié)果的計算：應(yīng)明確檢驗結(jié)果的計算方法。

【參考區(qū)間】

明確該產(chǎn)品的參考區(qū)間，并簡要說明其確定方法。建議注明“由于地理、人種、性別和年齡等差異，建議各實驗室建立自己的參考區(qū)間”。

【檢驗結(jié)果的解釋】

應(yīng)注明可能需要確認(rèn)的情況，如檢驗結(jié)果出現(xiàn)與臨床不符甚至相悖的情況，應(yīng)分析查找原因并重新確認(rèn)等。

【檢驗方法的局限性】

如試劑盒可稀釋，應(yīng)明確當(dāng)測定值超出線性上限時的稀釋方法以及最大稀釋倍數(shù)。

注明“本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，不能作為臨床確診依據(jù)，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮等”。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

通常包括以下內(nèi)容：

（1）試劑外觀；

（2）空白吸光度；

（3）線性范圍；

（4）準(zhǔn)確度；

（5）分析靈敏度；

（6）精密度（批內(nèi)精密度、批間差）。

【注意事項】

通常包括以下內(nèi)容：

（1）有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)的質(zhì)控品、校準(zhǔn)品或其他人源組分，雖已經(jīng)通過了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對待。

（2）對所有樣本和反應(yīng)廢棄物都應(yīng)視為傳染源對待。

5.臨床評價資料

該項目已經(jīng)列入《關(guān)于發(fā)布第三批免于進(jìn)行臨床試驗醫(yī)療器械目錄的通告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2017年第170號）免于進(jìn)行臨床試驗的體外診斷試劑目錄中。根據(jù)體外診斷試劑臨床評價的相關(guān)要求，申請人可按照《免于進(jìn)行臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價資料基本要求（試行）》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2017年第179號）要求進(jìn)行臨床評價。以下簡要說明臨床評價的相關(guān)要求。

臨床評價是指申請人通過對涵蓋預(yù)期用途及干擾因素的臨床樣本的評估、綜合文獻(xiàn)資料等非臨床試驗的方式對產(chǎn)品臨床性能進(jìn)行評價的過程。

5.1 研究方法

總膽固醇測定試劑盒目前已有相應(yīng)的參考方法（ALBK法、色譜法等）和境內(nèi)已上市同類產(chǎn)品，申請人可以選擇其中一種方法開展比較研究試驗。

5.2 樣本要求

評價用樣本應(yīng)來源于人體樣本，樣本的來源可追溯。評價用樣本應(yīng)涵蓋申請注冊產(chǎn)品預(yù)期用途和含有膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯、抗壞血酸等干擾物質(zhì)的樣本，并應(yīng)考慮到不同人群之間的差異等。所用樣本應(yīng)能夠充分的被用于評價產(chǎn)品臨床使用的安全性、有效性。

樣本數(shù)量應(yīng)采用合理的統(tǒng)計學(xué)方法（如目標(biāo)值法等）進(jìn)行計算，并符合統(tǒng)計學(xué)要求?？蛇x擇總樣本量不少于40例并分別采用待評價試劑和對比試劑/參考方法進(jìn)行雙份測定的方式，亦可選擇總樣本量不少于100例并分別采用待評價試劑和對比試劑/參考方法進(jìn)行單次測定的方式。其中參考區(qū)間以外樣本應(yīng)不少于50%，同時應(yīng)注重醫(yī)學(xué)決定水平（6.2mmol/L）附近樣本的選擇，并盡量涵蓋檢測范圍。

評價用的樣本類型應(yīng)與注冊申請保持一致。對于具有可比性的不同樣本類型，如血清和血漿樣本，可在分析性能評估中對樣本適用性進(jìn)行研究，或在臨床評價中對每種樣本類型分別進(jìn)行符合統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的評估。

5.3 試驗操作及周期

申請人可以通過對總樣本量不少于40例，用待評價試劑和對比試劑/參考方法進(jìn)行平行試驗，對每份臨床樣本作雙份測定。在試驗操作過程中應(yīng)對樣本進(jìn)行編盲，試驗檢測周期至少為5d。

申請人也可以通過對總樣本量不少于100例，用待評價試劑和對比試劑/參考方法進(jìn)行平行試驗，作單次測定。在試驗操作過程中應(yīng)對樣本進(jìn)行編盲，試驗檢測周期至少為5d。

5.4 數(shù)據(jù)收集和處理

應(yīng)首先進(jìn)行離群值觀察，離群值的個數(shù)不得超過限值。若未超限，可刪除離群值后進(jìn)行分析；若超出限值，則需合理分析原因并考慮糾正措施，必要時重新收集樣本進(jìn)行分析。離群值分析和處理方法應(yīng)有依據(jù)。

5.5 統(tǒng)計學(xué)分析

對試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如相關(guān)分析、線性回歸、偏倚/偏差分析等。對于對比試驗的等效性研究，最常用是對待評試劑和對比試劑/參考方法兩組檢測結(jié)果的相關(guān)及線性回歸分析，應(yīng)重點觀察相關(guān)系數(shù)（r值）或判定系數(shù)（R2）、回歸擬合方程（斜率和y軸截距）等指標(biāo)。

6.小結(jié)

本文所述內(nèi)容是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系的認(rèn)知，旨在期望能夠為注冊申請人準(zhǔn)備總膽固醇測定試劑盒（CHOD-PAP法）注冊申報資料時提供參考。

[1] 中國成人血脂異常防治指南修訂聯(lián)合委員會.中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)[J].中國循環(huán)雜志,2016,31(10):937-953.

[2] 尚紅,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程(第4版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2015.

[3] U.S. Food & Drug Administrion. Guidance for 510(k)s on Cholesterol Tests for Clinical Laboratory, Physicians' Oきce Laboratory and Home Use[S].1995-07-13.https://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm094140.htm.