譚念，李心樂，翟麗東，劉大全，張平

肥胖是由多種因素引起的能量和代謝失衡性慢性疾病，以體內(nèi)脂肪沉積異常過多為特點，并伴有冠心病、高血壓、2型糖尿病、高脂血癥和非酒精性脂肪肝（NAFLD）等一系列全身性疾?。?］。肝臟脂肪變性是NAFLD的早期癥狀，其特點是肝臟脂質(zhì)過多積累［2］。目前對于肥胖和脂肪肝尚無特異性的藥物治療［3］。機械加載是一種脈沖式關節(jié)加載，該方法以一定頻率的溫和動態(tài)加載力作用于膝關節(jié)等滑膜關節(jié)，進行機械刺激，通過作用于骨干的微小原位機械應力引起全身的相關合成代謝反應。筆者早期的研究表明，機械加載能夠預防骨關節(jié)炎中的組織退化、減少股骨頭壞死后的骨質(zhì)流失以及促進骨折愈合［4-5］。迄今為止，機械加載對肥胖和脂肪肝的作用尚不清楚。因此，本研究通過建立高脂飲食誘導肥胖和脂肪肝的動物模型，探討機械加載是否可改善肥胖和肝脂肪變性，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的角度探討其可能的病理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量約18 g，購自解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，實驗所用飼料購自北京華阜康生物科技有限公司，高脂飼料含脂量為60%。實驗動物的飼養(yǎng)與管理過程均嚴格遵守天津醫(yī)科大學實驗動物管理規(guī)定，本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 油紅O染色試劑盒購于Sigma公司，轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）抗體、真核啟動因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）抗體和真核啟動因子2α磷酸化（eukaryotic promoter2α phosphorylation，p-eIF2α）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 采用隨機數(shù)字表法將動物分成3組，正常對照（NC）組、高脂飲食（HF）組和高脂飲食機械加載治療（HF+L）組，每組10只。在實驗起始階段，各組動物體質(zhì)量沒有明顯差異。NC組給予正常飲食，HF和HF+L組給予高脂飲食，持續(xù)飲食誘導12周。整個實驗過程中保證小鼠充足的食水，小鼠自由進食、進水。室溫22～25℃，相對濕度約50%，明暗各12 h的照明條件。

1.2.2 機械加載 高脂誘導6周后，HF+L組小鼠經(jīng)1.5%異氟烷麻醉后，采用自制的小動物關節(jié)加載治療儀進行治療。將小鼠膝關節(jié)外側(cè)、內(nèi)側(cè)置于加載桿和定子之間，松緊應適宜，太緊會影響血流供應，以能觸及到小鼠踝關節(jié)動脈跳動為標準（圖1）。加載力為1 N，加載頻率為10 Hz，每天加載6 min，每側(cè)膝關節(jié) 3 min，每周連續(xù)加載5 d［6］，連續(xù)加載6周。小鼠加載治療期間，HF+L組持續(xù)高脂喂養(yǎng)，直至實驗結(jié)束。NC組和HF組接受假機械加載治療，即小鼠給予麻醉后，同樣將膝關節(jié)置于加載儀，但不接受任何機械刺激。

1.2.3 收集動物體質(zhì)量、脂肪含量等數(shù)據(jù) 每周固定時間用電子稱（精密度0.01 g）測量并記錄小鼠體質(zhì)量，每3天統(tǒng)計1次小鼠攝食量。處死動物前12 h，小鼠禁食不禁水，取血測量小鼠空腹血糖。動物處死后，分離小鼠肝臟，稱濕質(zhì)量并記錄。一部分肝臟固定于4%多聚甲醛，用于組織形態(tài)學分析；一部分肝臟用于Western blot分析。同時，收集小鼠腹股溝脂肪、子宮周脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪，稱濕質(zhì)量并記錄。

1.2.4 體成分分析 小鼠經(jīng)1.5%異氟烷面罩吸入麻醉小鼠，測量體質(zhì)量、體長（鼻尖至肛門），將所得數(shù)據(jù)輸入體成分分析儀，按要求將探針刺入小鼠皮下（圖2）。紅色探針置于鼻尖處，黃色探針置于兩耳連線中點處，藍色探針置于肛門上方處，黑色探針置于尾巴距離藍色探針1 cm處，然后開始測量并記錄體脂含量。

1.2.5 組織形態(tài)學觀測 小鼠新鮮肝臟經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，部分肝臟組織經(jīng)蔗糖梯度脫水后進行冰凍切片，切片厚度8 μm，選取同一位置的切片進行油紅O染色，光鏡下觀察肝脂肪變性程度；部分肝臟組織經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋后進行切片，切片厚度5 μm，同樣選取同一位置的切片進行常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察3組肝組織切片的病理改變。每組選取7個樣本切片，每個切片選擇5個鏡下視野進行統(tǒng)計。

1.2.6 Western blot分析 每組分別取3個肝臟標本，稱取小鼠肝臟50 mg，冰上剪碎后置于研磨管中，加含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液0.5 mL，冰上裂解20 min后研磨成勻漿，14 000×g離心15 min，提取總蛋白，測量蛋白濃度。上樣總蛋白濃度20 μg，加5×上樣緩沖液，100℃變性5 min，采用10%分離膠進行SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。再使用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后，一抗4℃孵育過夜，1×TBST清洗3次，二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光、X線膠片曝光、顯影和定影后用凝膠成像系統(tǒng)檢測相關蛋白的表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 機械加載對高脂飲食誘導的肥胖小鼠的治療作用 實驗期間，3組小鼠攝食量無明顯差異。與NC組小鼠相比，HF組小鼠體型較大，治療后HF+L組與HF組相比體型較小，見圖3。高脂喂養(yǎng)2周后，與NC組相比，HF組小鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05），6周后體質(zhì)量持續(xù)增長（均P＜0.05）。機械加載治療2周后（第8周），HF+L組小鼠體質(zhì)量較HF組顯著降低，但仍然比NC組體質(zhì)量高，治療3周后體質(zhì)量趨于平穩(wěn)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 The body weight changes throughout the experiment in three groups of mice表1 整個實驗過程中3組小鼠的體質(zhì)量變化（n=10，g，±s）

Tab.1 The body weight changes throughout the experiment in three groups of mice表1 整個實驗過程中3組小鼠的體質(zhì)量變化（n=10，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與HF組比較，P＜0.05；表2～4同

組別NC組HF組HF+L組F第2周18.98±0.27 19.86±0.22a 20.52±0.28a 6.692＊＊第4周20.83±0.49 22.59±0.28a 22.60±0.45a 4.770＊第6周20.93±0.37 24.74±0.54a 24.90±0.70a 9.898＊＊NC組HF組HF+L組F 21.20±0.28 27.98±0.81a 25.97±0.40ab 24.600＊＊22.53±0.55 30.43±0.89a 27.21±0.99ab 14.900＊＊22.67±0.53 32.05±0.99a 27.36±0.98ab 19.800＊＊

2.2 機械加載的降脂作用 體成分分析結(jié)果表明，與NC組相比，高脂飲食導致HF組小鼠全身體脂含量增加。機械加載干預后，HF+L組較HF組體脂含量降低，但仍高于NC組體脂含量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。長期高脂飲食導致HF組空腹血糖高于NC組（P＜0.05），而HF+L組血糖明顯低于HF組（P＜0.05），并且恢復到NC組血糖水平，見表2。

Tab.2 Comparison of body fat content,fasting blood glucose and hepatic adipocyte number between three groups of mice表2 小鼠體脂含量、空腹血糖和肝臟脂肪細胞數(shù)目比較（±s）

Tab.2 Comparison of body fat content,fasting blood glucose and hepatic adipocyte number between three groups of mice表2 小鼠體脂含量、空腹血糖和肝臟脂肪細胞數(shù)目比較（±s）

組別NC組HF組HF+L組F體脂含量（n=10，%）35.57±2.28 53.39±1.21a 47.75±1.24ab 31.760＊＊血糖（n=10，mmol/L）4.22±0.26 9.52±0.85a 4.54±0.39b 27.940＊＊肝臟脂肪細胞數(shù)目（n=7，個）0 60.58±4.21a 9.90±1.64ab 71.650＊＊

2.3 機械加載對不同部位脂肪組織的作用 與NC組相比，HF組腎周脂肪、子宮周脂肪、腸系膜脂肪、腹股溝脂肪均增加（均P＜0.05）。治療干預后，HF+L組各部位脂肪質(zhì)量較HF組顯著降低，但仍高于NC組（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 The comparison of adipose tissue mass between different tissues表3 各部位脂肪組織質(zhì)量的比較（n=10，g，±s）

Tab.3 The comparison of adipose tissue mass between different tissues表3 各部位脂肪組織質(zhì)量的比較（n=10，g，±s）

組別NC組HF組HF+L組F腎周脂肪0.13±0.01 0.93±0.13a 0.58±0.10ab 11.520＊＊子宮周脂肪0.29±0.01 1.49±0.18a 0.98±0.15ab 11.930＊＊腹股溝脂肪0.24±0.01 1.41±0.18a 0.91±0.10ab 15.110＊＊腸系膜脂肪0.22±0.02 0.57±0.06a 0.41±0.03ab 13.610＊＊

2.4 機械加載對肝臟組織中脂肪細胞的作用 與NC組相比，HF組肝臟發(fā)生脂肪變性，肝臟體積增大，顏色輕度發(fā)黃，而HF+L組肝臟體積較HF組變小，肝臟顏色紅潤，見圖4。肝臟組織HE染色顯示，NC組小鼠肝臟組織肝索結(jié)構正常，肝細胞大小均勻，細胞核圓，胞質(zhì)豐富；HF組肝索結(jié)構遭到破壞，脂肪細胞導致肝細胞排列紊亂，而HF+L組肝索結(jié)構較HF組規(guī)則，肝細胞核圓；與NC組相比較，HF組肝臟組織出現(xiàn)大量形態(tài)規(guī)則的白色空泡樣脂肪細胞（圖5黑色箭頭所示），而HF+L組脂肪細胞較HF組明顯減少。油紅O染色結(jié)果顯示，HF組肝臟組織出現(xiàn)大量紅色著染的脂肪細胞（圖6白色箭頭所示），HF+L組幾乎沒有紅色著染。將脂肪細胞量化后結(jié)果表明，HF組脂肪細胞較NC組明顯增多，HF+L組脂肪細胞較HF組顯著減少，但與NC組相比，仍然有一定數(shù)量的脂肪細胞（P＜0.05），見表2。

2.5 機械加載對肝臟組織中p-eIF2α和ATF4表達的影響 肝臟組織蛋白檢測分析表明，與NC組相比，HF組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白p-eIF2α、eIF2α和ATF4的表達顯著升高，而HF+L組較HF組明顯降低（均P＜0.05），與NC組相比差異無統(tǒng)計學意義，見表4、圖7。

Tab.4 The marker proteins of endoplasmic reticulum stress detected by Western blot assay in three groups表4 Western blot檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性標志蛋白的表達（n=3，±s）

Tab.4 The marker proteins of endoplasmic reticulum stress detected by Western blot assay in three groups表4 Western blot檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性標志蛋白的表達（n=3，±s）

組別NC組HF組HF+L組F p-eIF2α/eIF2α 0.81±0.08 1.39±0.12a 0.87±0.05b 11.770＊＊ATF4 0.73±0.04 1.14±0.07a 0.83±0.05b 13.360＊＊

Fig.7 The marker proteins of endoplasmic reticulum stress detected by Western blot assay in three groups圖7 Western blot檢測3組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記性蛋白的表達

3 討論

3.1 機械加載治療對體質(zhì)量、體脂的作用 高熱量食物的攝入和缺乏運動鍛煉是導致肥胖的主要原因，而機體對于過剩的能量最初始的反應是將多余的能量儲存于脂肪細胞［7］。盡管能量可以以此種形式儲存于體內(nèi)，但是脂肪組織的過度堆積會成為導致代謝性疾病的主要高危因素。本課題組通過長期高脂飲食誘導小鼠建立肥胖動物模型，6周高脂飲食誘導后，HF組小鼠體質(zhì)量顯著高于NC組，各部位脂肪組織也顯著增加。運動鍛煉被認為是減輕體質(zhì)量最有效的治療方法，同時可以提高心肺功能和整體生活質(zhì)量［8］。但一些有基礎疾病的老年人或身體殘疾者難以進行運動鍛煉，并且過度的運動可能會有肌肉損傷和骨折的風險。因此，本研究探討了膝關節(jié)加載對肥胖的影響，結(jié)果提示膝關節(jié)加載治療通過降低體質(zhì)量和全身體脂含量，有效緩解了高脂飲食導致的肥胖的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果表明，膝關節(jié)加載可以作為一種新的物理康復理療方式，改善肥胖相關的脂質(zhì)代謝異常。

3.2 機械加載對肥胖和脂肪肝的療效 NAFLD是以肝臟脂質(zhì)沉積和肝細胞脂肪變性為基本特征的一類疾病，是肥胖最嚴重的并發(fā)癥之一［9］。肥胖和NAFLD之間關系密切，據(jù)報道約90%的肥胖患者伴有NAFLD，其嚴重程度與肥胖的程度成正比［10］。作為體內(nèi)參與代謝的一個重要器官，肝臟對超重或肥胖極其敏感，體內(nèi)脂肪的減少會導致肝臟中的脂滴減少和肝功能指數(shù)升高。研究表明內(nèi)臟脂肪增加會增加患脂肪肝的風險，并且兩者之間的關系呈正相關［11-12］，本研究中，高脂導致了內(nèi)臟脂肪（腎周脂肪、腸系膜脂肪和子宮周脂肪）的顯著增加，而機械加載治療有效減少了內(nèi)臟脂肪的堆積。肝臟組織學分析結(jié)果也表明，長期高脂飲食導致肝臟組織內(nèi)脂滴異常沉積。反之，膝關節(jié)加載干預治療通過減少肝內(nèi)脂肪沉積而緩解了NAFLD的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果表明膝關節(jié)加載改善了高脂飲食導致的肝脂肪變性，為治療肝臟脂質(zhì)代謝異常提供了新的策略。

3.3 機械加載治療脂肪肝中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用機制 很多研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在肥胖以及NAFLD發(fā)展中起著至關重要的作用［13-15］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激不僅是肝臟脂肪堆積的結(jié)果，也是造成這種病理表現(xiàn)的原因。在脂肪肝中，脂肪生成過多和脂肪沉積異常會導致慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激［13］。肝臟是葡萄糖和脂質(zhì)代謝的主要場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的非折疊蛋白反應通路激活又是肝糖元和脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)通路［16］。同時，本研究結(jié)果也表明長期高脂飲食導致血糖異常升高，機械加載能夠有效降低異常升高的血糖，并使其控制在正常范圍內(nèi)。為了探討膝關節(jié)加載是否通過影響肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而起到了這一系列的治療作用，本研究檢測了與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的PERK-ATF4軸蛋白水平的表達，結(jié)果顯示在HF組小鼠p-eIF2α和ATF4蛋白表達水平升高，說明長期高脂飲食導致了慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。然而，在6周機械加載治療后，這些蛋白表達水平顯著降低。以上結(jié)果表明膝關節(jié)加載對肥胖和非酒精性脂肪肝的治療作用可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關。

（圖1～6見插頁）

Fig.2 The fixation of the surgical aspirator圖2 吸引器的固定

Fig.3 Preoperative brain CT of case1圖3 病例1術前頭部CT

Fig.4 The postoperative brain CT 6 h after operation of case 1圖4 病例1手術后6 h復查頭部CT

Fig.5 Preoperative brain CT of case 2圖5 病例2術前頭部CT

Fig.6 The postoperative brain CT 6 h after operation of case 2圖6 病例2手術后6 h復查頭部CT

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