羅祎敏，曹曉誠(chéng)，李 翔，崔迎紅，許 暢，陳 阿，曹建國(guó)

(1. 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410013；3. 湖南師范大學(xué)湖南省小分子靶向藥物研制與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

大量研究證據(jù)表明，包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤存在極少量的具有致癌能力的腫瘤細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)[1]。腫瘤干樣細(xì)胞特性的增強(qiáng)涉及多種惡性腫瘤的起始、致癌能力、多藥耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2]。現(xiàn)有的氟尿嘧啶、紫杉醇、順鉑等化療藥物對(duì)肝細(xì)胞癌的治療效果不佳，主要是由于其嚴(yán)重的毒副作用和誘導(dǎo)CSCs生成[3]。因此，迫切需要研究和開(kāi)發(fā)毒性小、靶向抑制或消除CSCs或腫瘤干樣細(xì)胞致癌性質(zhì)的新型制劑[4]。

微小RNA (miR)是一類(lèi)～22-nt單鏈非編碼RNA，在調(diào)節(jié)致癌途徑中起關(guān)鍵作用[5]。有研究報(bào)道[6]，人肝細(xì)胞癌miR-519d下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-519d抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞系QGY-7703生長(zhǎng)。然而，miR-519d在維持肝癌干樣細(xì)胞(liver cancer stem-like cells, LCSLCs)致癌能力中的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。

8-溴-7-甲氧基白楊素 (8-bromo-7-methoxychrysin, BrMC)是自主設(shè)計(jì)和合成的具有較白楊素更強(qiáng)抗腫瘤活性的新型類(lèi)似物[4]。先前的研究證實(shí)，BrMC下調(diào)Twsit1蛋白表達(dá)，抑制SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞自我更新能力[4,7]。Yue等[5]報(bào)道，miR-519d通過(guò)Twist1和Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，抑制胃癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究探討B(tài)rMC是否通過(guò)上調(diào)miR-519d，下調(diào)Twist1表達(dá)，抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs的體外致癌能力。

1 材料

1.1細(xì)胞株人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2試劑按照文獻(xiàn)[8]描述的方法合成BrMC，終濃度0.1%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM培養(yǎng)基溶解。胰島素、鼠抗人β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；重組人表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)、B27添加物、DMEM/F12培養(yǎng)基、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、LipofectamineTM2000試劑，均購(gòu)自Invitrogen公司；兔抗人Twist1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記兔抗鼠Ig G、山羊抗兔Ig G二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司；miR-519d引物、U6引物、hsa-miR-519d模擬物、519d抑制物、亂序?qū)φ展押塑账?、pcDNA3.1-Twist1(NM_000474)或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-LacZ，均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific)；SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(Promega公司)；Bradford試劑盒(美國(guó)Bio-Rad Laboratories Hercules公司)。

1.3儀器HF 212 uv二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)SHEL-LAB公司)；YJ-875醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；IX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；掃描儀(Ranon GIS-2008, 上海天能科技有限公司)；DDY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)；轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1球細(xì)胞培養(yǎng)用含生長(zhǎng)因子(EGF和FGF)、胰島素、B27添加物的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮SMMC-7721細(xì)胞，每孔104個(gè)細(xì)胞，接種入超低黏附6孔板。懸浮培養(yǎng)6 d得到三維克隆性生長(zhǎng)細(xì)胞球(≥30細(xì)胞)；胰蛋白酶-EDTA消化，200×g離心10 min，機(jī)械分散獲得球細(xì)胞。以104個(gè)細(xì)胞/孔密度再次接種入超低黏附6孔板，培養(yǎng)6 d，獲得第2代球細(xì)胞作為L(zhǎng)CSLCs，用于隨后的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2實(shí)時(shí)定量PCR用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)操作步驟，以SYBR?Premix Ex TaqTM檢測(cè)miR-519d和 U6表達(dá)。擴(kuò)增條件如下：95℃變性15 s, 60℃復(fù)性/延伸60 s循環(huán)40次。所有樣本一式3份，相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)步驟，使用LipofectamineTM2000試劑，以100 nmol·L-1終濃度將hsa-miR-519d模擬物或亂序?qū)φ展押塑账?、pcDNA3.1-Twist1或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-LacZ轉(zhuǎn)染SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs。

2.4球形成率測(cè)定用含生長(zhǎng)因子(EGF和FGF)、胰島素和B27添加物的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，以1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種入24孔超低黏附培養(yǎng)板，培養(yǎng)6 d，計(jì)數(shù)腫瘤球，球形成率，按照公式：每孔平均腫瘤球數(shù)/接種活細(xì)胞數(shù)(1 000)×100%計(jì)算。

2.5集落形成實(shí)驗(yàn)首先將含0.8% 瓊脂糖和10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基0.5 mL加入到24孔板中，作為底層。然后，含1×107·L-1細(xì)胞、0.4%瓊脂糖和20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基0.5 mL接種至底層之上。每4 d添加含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基0.5 mL，孵育2周。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落(≥20細(xì)胞)。瓊脂集落形成率按照公式：每孔平均集落數(shù)/接種活細(xì)胞數(shù)(1 000)×100%計(jì)算。

2.6質(zhì)粒構(gòu)建及熒光素酶活性測(cè)定PCR擴(kuò)增含有miR-519d結(jié)合位點(diǎn)的人野生型Twist1 mRNA 3′-UTR，并插入pMIR-REPORTTM熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的SpeI / HindIII位點(diǎn)，以產(chǎn)生pMIR-Twist1-wt質(zhì)粒。Twist1 3′-UTR中miR-519d的互補(bǔ)序列突變，命名為pMIR-Twist1-mut質(zhì)粒。通過(guò)Lipofectamine 2000試劑將miR-519d模擬物和pMIR-Twist1-WT或pMIR-Twist1-MUT共轉(zhuǎn)染LCSLCs。轉(zhuǎn)染后48 h，裂解細(xì)胞，并使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性。

2.7蛋白質(zhì)印跡細(xì)胞用冰冷的PBS液洗滌2次，加入1.0 mL RIPA緩沖液冰上孵育20 min，13 200 r·min-1、4℃離心5 min制備全細(xì)胞裂解液，Bradford試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。含50 μg蛋白的細(xì)胞裂解物在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以抗Twist 1和抗β-actin抗體作為一抗，使用ECL試劑盒檢測(cè)印跡信號(hào)。

2.8BrMC處理參照文獻(xiàn)[4]描述的方法，選用BrMC(終濃度1、3、10 μmol·L-1) 處理SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs 24 h。

3 結(jié)果

3.1SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCsmiR-519d表達(dá)下調(diào)、Twist1表達(dá)上調(diào)與SMMC-7721細(xì)胞比較，SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs (SMMC-7721細(xì)胞系第2代球細(xì)胞)miR-519d表達(dá)下調(diào)(Fig 1A)；同時(shí)，Twist1蛋白表達(dá)上調(diào) (Fig 1B，P<0.05)。Fig 1C、1D球形成和瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs相比SMMC-7721細(xì)胞的球和瓊脂集落形成率增高(P<0.05)。

3.2BrMC上調(diào)miR-519d表達(dá)、下調(diào)Twist1蛋白表達(dá)Fig 2A、2B實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果證明，BrMC(1、3、10 μmol·L-1)劑量依賴(lài)性增高SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs miR-519d表達(dá)水平(P<0.05)，并降低Twist1蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。Fig 2C、2D表明，BrMC以濃度依賴(lài)方式抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs球和瓊脂集落形成能力(P<0.05)。

Fig 1 Comparison of expressions of miR-519d and Twist1 between SMMC-7721 cells and LCSLCs(n=3)

A: Expression of miR-519d assessed by qRT-PCR; B: Expression of Twist1 protein analyzed by Western blot; C: Sphere forming rate determined by sphere formation assay; D: Colony forming rate determined by colony formation assay in agar. SMMC: Human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cell line; LCSLC: The second-generation spheres derived from SMMC-7721 cell line.*P<0.05vsSMMC-7721 cells.

Fig 2 Effects of BrMC on expressions of miR-519d and Twist1 in SMMC-7721-derived LCSLCs(n=3)

A:Effect of various concentrations of BrMC (1.0, 3.0, 10.0 μmol·L-1) on expression of miR-519d assessed by qRT-PCR; B: Effect of various concentrations of BrMC (1.0, 3.0, 10.0 μmol·L-1) on expression of Twist1 protein analyzed by Western blot; C: Effect of various concentrations of BrMC (1.0, 3.0, 10.0 μmol·L-1) on sphere forming rate determined by sphere formation assay; D: Effect of various concentrations of BrMC (1.0, 3.0, 10.0 μmol·L-1) on colony forming rate determined by colony formation assay in Agar.*P<0.05vs0.0 μmol·L-1BrMC;#P<0.05vs1.0 μmol·L-1BrMC group.

Fig 3 Effects of co-transfected with miR-519d mimic and pmiR-Twist1-WT on expressions of miR-519d and Twist1 in SMMC-7721-derived LCSLCs (n=3)

A:Bioinformatics analysis of between miR-519d and Twist1 recognition sequences by miRanda (http://mircorna.org) revealed the miR-519d had a binding site with Twist1; B: miR-519d mimic decreased the luciferase activities in Twist1-WT+miR-519d mimic group, but did not affect luciferase activity by transfecting miR-519d mimic+Twist1-MUT group into SMMC-7721-derived LCSLCs; C: Effect of miR-519d mimic on expression of Twist1 protein analyzed by Western blot; D: Effect of miR-519d mimic on sphere forming rate determined by sphere formation assay; E: Effect of miR-519d mimic on colony forming rate determined by colony formation assay in agar.*P<0.05vstransfected with scrambled control oligos(miR-Control).

3.3Twist1是miR-519d在SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs中的靶基因在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件miRanda(www.mircrorna.org)的生物信息學(xué)分析顯示，Twist1是miR-519d的潛在靶標(biāo)(Fig 3A)。含熒光素酶報(bào)告基因的野生型(pmiR-Twist1-WT)或突變型Twist1(pmiR-Twist1-MUT)3′UTR的質(zhì)粒，分別與miR-519d模擬物共轉(zhuǎn)染入SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs。結(jié)果表明，SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs中的pmiR-Twist1-WT-3′UTR的相對(duì)熒光素酶活性降低36%，但不影響突變體3′UTR的相對(duì)螢光素酶活性(Fig 3B)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-519d模擬物轉(zhuǎn)染的SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs Twist1蛋白水平降低(Fig 3C)。此外，miR-519d模擬物轉(zhuǎn)染的SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs球和集落形成率下降(Fig 3D、3E)。

3.4miR-519d模擬物對(duì)BrMC調(diào)節(jié)miR-519d和Twist1表達(dá)作用的影響miR-519d功能獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-519d模擬物轉(zhuǎn)染協(xié)作BrMC (3 μmol·L-1)上調(diào)miR-519d表達(dá)(Fig 4A,P<0.05)，下調(diào)Twist1蛋白表達(dá)(Fig 4B,P<0.05)。值得注意的是，miR-519d模擬物還能協(xié)作增強(qiáng)BrMC (3 μmol·L-1)抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs球和瓊脂集落形成效應(yīng) (Fig 4C、4D，P<0.05 )。

3.5TWIST1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)BrMC調(diào)節(jié)miR-320和Twist1表達(dá)作用的影響TWIST1基因的功能獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，pcDNA3.1-Twist1不影響B(tài)rMC (3 μmol·L-1)上調(diào)miR-519d表達(dá)作用(Fig 5A)；然而，有效地拮抗BrMC(3 μmol·L-1) 下調(diào)Twist1蛋白表達(dá)(Fig 5B,P<0.05)。此外，pcDNA3.1-Twist1減弱BrMC(3 μmol·L-1)抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs球和瓊脂集落形成效應(yīng)(Fig 5C、5D，P<0.05)。

4 討論

Cao等[1]報(bào)道，球形成法是分離和鑒別具有肝癌干細(xì)胞特性的LCSLCs特別有用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。我們先前的研究通過(guò)比較原代、第2代、第3代和第4代球細(xì)胞的球形成率，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細(xì)胞系第2代球細(xì)胞形成第3代球細(xì)胞時(shí)的球形成率最高，也就是說(shuō)其具有最強(qiáng)的球形成潛能；此外，第2代球細(xì)胞較SMMC-7721細(xì)胞有更高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物(CD133、CD44、ALDH1),以及更強(qiáng)的裸鼠體內(nèi)成瘤能力。所以，我們推測(cè)SMMC-7721細(xì)胞系第2代球細(xì)胞富集了肝癌干細(xì)胞，并定義其為L(zhǎng)CSLCs[7]。

Fig 4 Effects of miR-519d mimic on expressions of miR-519d and Twist1 regulated by BrMC in SMMC-7721-derived LCSLCs(n=3)

A: Effect of miR-519d mimic on expression of miR-519d regulated by BrMC assessed by qRT-PCR; B: Effect of miR-519d mimic on expression of Twist1 protein regulated by BrMC analyzed by Western blot; C: Effect of miR-519d mimic on sphere forming rate regulated by BrMC determined by sphere formation assay; D: Effect of miR-519d mimic on colony forming rate regulated by BrMC determined by colony formation assay in agar.*P<0.05vsLCSLCs transfected with scrambled control oligos(miR-Control);#P<0.05vsLCSLCs transfected with scrambled control oligos(miR-Control) by treatment with 3.0 μmol·L-1BrMC.

本實(shí)驗(yàn)研究首先證明，相比SMMC-7721細(xì)胞，人肝細(xì)胞癌SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs miR-519d低表達(dá)，Twist1蛋白表達(dá)上調(diào)。其次，我們不僅證實(shí)miR-519d直接靶向Twist1的3′非翻譯區(qū)，并調(diào)節(jié)Twist1蛋白表達(dá)；而且發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-519d抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs體外致癌能力。其三，過(guò)表達(dá)TWIST1不影響miR-519d表達(dá)水平，但有效增強(qiáng)SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs體外致癌能力。我們的結(jié)果與Yue等[5]的研究結(jié)果相似，建議miR-519d，靶向抑制TWIST1基因，是一種抑制LCSLCs致癌能力的腫瘤抑制基因。

在多種類(lèi)型的腫瘤中，人們對(duì)miR-519d表達(dá)和功能進(jìn)行了廣泛的研究。如Zhou等[9]確定宮頸癌組織miR-519d表達(dá)降低，并且異位表達(dá)miR-519d,通過(guò)抑制Smad7表達(dá)抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移。Xie等[10]研究證明，過(guò)表達(dá)miR-519d靶向抑制MCL-1基因表達(dá)，增強(qiáng)耐藥乳腺癌干細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性。然而，迄今為止，還沒(méi)有關(guān)于miR-519d對(duì)LCSLCs功能和特性作用的研究報(bào)道。

Twist是介導(dǎo)中胚層、成肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子[11]。在晚期肝細(xì)胞癌中，Twist蛋白水平升高導(dǎo)致預(yù)后差[12]。我們先前的研究表明，BrMC通過(guò)下調(diào)Twist表達(dá)，抑制肝癌干細(xì)胞自我更新[7]。最近幾項(xiàng)研究表明，miRNA在惡性腫瘤調(diào)節(jié)TWIST1基因表達(dá)中起重要作用。Zhu等[12]證實(shí)，miR-186通過(guò)調(diào)節(jié)TWIST1，抑制卵巢癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞周期G1期阻滯，并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。Li等[13]的研究確定TWIST1是miR-320直接靶基因。Yue等[5]證實(shí)，miR-519d通過(guò)Twist1和Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，抑制胃癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果證實(shí)，miR-519d直接靶向Twist1 mRNA 3′非翻譯區(qū)，并調(diào)節(jié)Twist1蛋白表達(dá)，TWIST1基因功能獲得能有效對(duì)抗miR-519d抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs體外致癌作用。

Fig 5 Effects of transduction of TWIST1 gene on expressions of miR-519d and Twist1 regulated by BrMC in SMMC-7721-derived LCSLCs(n=3)

A:Effect of transduction of TWIST1 gene on expression of miR-519d regulated by BrMC assessed by qRT-PCR; B: Effect of transduction of TWIST1 gene on expression of Twist1 protein regulated by BrMC analyzed by Western blot; C: Effect of transduction of TWIST1 gene on sphere forming rate regulated by BrMC determined by sphere formation assay; D: Effect of transduction of TWIST1 gene on colony forming rate regulated by BrMC determined by colony formation assay in agar.*P<0.05vsLCSLCs transducted with pcDNA3.1-LacZ;#P<0.05vsLCSLCs transducted with pcDNA3.1-LacZ by treatment with 3.0 μmol·L-1BrMC.

本實(shí)驗(yàn)研究還證實(shí)，新型白楊素類(lèi)似物BrMC通過(guò)調(diào)控miR-519/Twist1信號(hào)軸，抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs體外致癌能力，揭示了一種BrMC抗腫瘤作用新型分子機(jī)制。有關(guān)BrMC抑制CSCs或腫瘤干樣細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和CSCs功能和特性作用已經(jīng)有多篇報(bào)道[3-4,7,14]。在先前的研究中，我們亦證明BrMC優(yōu)先抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs增殖，對(duì)人胚肝L-02細(xì)胞存活力影響小[3]。我們新近報(bào)道，BrMC通過(guò)阻斷STAT3/Twist信號(hào)軸，抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs球形成和侵襲能力[4]。盡管BrMC如何通過(guò)STAT3和miR-519d及兩者相互作用來(lái)調(diào)控Twist1表達(dá)，抑制LCSLCs干細(xì)胞特性還有待進(jìn)一步研究，然而本文的研究結(jié)果清楚地闡釋了BrMC通過(guò)上調(diào)miR-519d，下調(diào)Twsit1蛋白表達(dá)，抑制SMMC-7721源性L(fǎng)CSLCs體外致癌能力新的作用分子機(jī)制。

總之，我們的研究結(jié)果探索了白楊素新型類(lèi)似物BrMC以微小RNAs為靶標(biāo)，抑制腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞致癌能力的可能性。但是，有關(guān)白楊素類(lèi)似物BrMC調(diào)控miR-519d/Twist1信號(hào)軸，抑制LCSLCs致癌能力的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值仍然需要深入評(píng)價(jià)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成的，感謝任凱群副教授、全梅芳實(shí)驗(yàn)師的幫助，特此致謝！)

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