文 婷，付永莉，羅 婷，周 坤，李鴻杰

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢精神衛(wèi)生中心藥學部，湖北 武漢 430022)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是僅次于阿爾茨海默病的第2大神經退行性疾病， 60歲以上老年人中，約有1%～2%人群深受PD困擾[1]。PD的病理特征主要是大腦黑質致密部多巴胺能神經元的進行性損傷，導致多巴胺能神經元大量減少，形成以α-突觸核蛋白(α-synuclein)為主要成分的Lewy小體，最終引起動作遲緩、肌肉僵直、靜止性震顫等行為功能障礙[2]。盡管目前多巴胺能神經元損傷的具體機制仍不明確，但是越來越多的研究證實，大腦內活性氧自由基(reactive oxidative species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)增加導致的氧化損傷，在多巴胺能神經元的進行性退化病變中起著重要的作用[3]。能夠抑制神經元自由基生成或者快速清除細胞內自由基的抗氧化劑，在多種PD模型中都表現出良好的治療效果[2,4]。

α-苯基-N-叔丁基硝酮(phenyl N-tert-butylnitrone，PBN)是第1個被報道的神經保護劑[5]，其分子結構中含有1個硝酮基團，能夠與多種自由基反應，具有較強的抗氧化能力，在體外模型中能夠有效地清除多種自由基[5-6]。體內實驗也已經證明，PBN通過捕獲自由基，降低氧化損傷，在腦中風、癡呆等多種神經系統(tǒng)疾病中有著良好的作用[7]。同時，一些已報道的含有硝酮基團的化合物，在多種體內和體外模型中，均能有效地保護多巴胺神經元，提高多巴胺(dopamine，DA)含量，明顯改善PD癥狀[2,8]?；诖?，我們認為自由基清除劑PBN也能夠通過有效清除自由基，從而保護多巴胺能神經元，改善PD癥狀，起到治療PD的作用。本研究通過神經毒素1-甲基-4-苯基吡啶/1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium/1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPP+/MPTP)誘導建立的PD體外和體內模型，評價了PBN對PD的治療作用。

1 材料

1.1細胞與試劑人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)來源于ATCC。N, N-二甲基-4-亞硝基苯胺(p-NDA)、5-氨基-3-(4-嗎啉基)-1, 2, 3-惡二唑鎓鹽酸鹽(SIN-1)、魯米諾，均購自Alfa Aesar公司；MPP+iodide、1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP)、2′, 7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、羥苯基熒光素[3'-(p-hydroxyphenyl) fluorescein，HPF]、二氫羅丹明123(DHR 123)、4-氨基-5-甲氨基-2’, 7’-二氟熒光素二酯(DAF-FM)，均購自Sigma Aldrich；兔抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxlase, TH)抗體(貨號sc-25269)、抗Nrf2抗體(貨號sc-365949)、抗血紅素氧化酶1(heme oxygenase 1，HO-1)抗體(貨號sc-136960)，均購自Santa Cruz公司； GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒，購自基因科技(上海)有限公司；PBN、司來吉蘭(Selegiline)購自Orion corporation；多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇等試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olmpus公司)；高效液相庫侖陣列電化學檢測系統(tǒng)(美國ESA公司)；高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；凝膠成像儀(加拿大Carestream Health公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；冰凍切片機(德國Leica公司)等。

1.3實驗動物SPF級♂C57BL/6小鼠30只，10周齡，體質量(23±2)g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院提供，許可證號：SYXK(鄂)2014-0049。

2 方法

2.1PBN對非細胞體系自由基的清除作用

2.1.1Fenton法檢測·OH清除能力 在Corning?48孔標準平底透明板中，依次加入50 μL濃度為1.0 mmol·L-1的p-NDA、300 μL H2O(空白對照組)或者300 μL不同濃度的PBN樣品液，在BioTek?SynergyTM4全波長多功能酶標儀上分別加入125 μL濃度為1.0 mmol·L-1的H2O2，以及125 μL濃度為2.0 mmol·L-1的FeSO4溶液，在Gen 5軟件界面上振板均勻后，于440 nm波長下測量吸光度。測定反應體系在100 s內吸光度的變化值，清除率以下列公式計算：清除率=[1-(A0-At)/A0]×100%，剛開始時A0及第100 s A100分別為扣除本底吸收后，在第0 s和第100 s時的吸光度值。

2.1.2化學發(fā)光法比較ONOO-清除能力 在光度計量管中使用微量移液器加入300 μL的PBS(pH=7.4)，然后加入100 μL各濃度的PBN樣品溶液(樣品組)或者0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)(對照組)，最后加入50 μL濃度為1.0 mmol·L-1的魯米諾溶液及50 μL SIN-1鹽酸溶液(3 g·L-1)激發(fā)反應。37℃條件下，以動力學模式總時間10 min，時間間隔為100 s，記錄發(fā)光值，重復3次后統(tǒng)計計算平均值。清除率=(A對照液-A樣品液)/A對照液×100%。

2.2細胞培養(yǎng)SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含10% FBS和2 mmol·L-1L-谷氨酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。細胞按照1×108·L-1接種于96孔板中，24 h后進行實驗。

2.3細胞存活率的檢測SH-SY5Y細胞接種24 h后吸掉原培養(yǎng)基，對照組和模型組用正常培養(yǎng)液替換，給藥組分別加入含不同濃度PBN(0.1、1、10 μmol·L-1)的培養(yǎng)基預保護2 h。除正常組外，其他組加入MPP+(終濃度為1 mmol·L-1)誘導24 h。MTT試劑盒檢測細胞存活率。

2.4細胞內自由基的檢測SH-SY5Y細胞接種于96孔板(黑色邊，底部透明，貨號3603，Corning Corporation, USA)中，每孔接種1×104個/100 μL，24 h后吸走培養(yǎng)基，加藥組分別加入不同濃度PBN(0.1、1、10 μmol·L-1)，對照組和模型組只加入培養(yǎng)基，孵育2 h后，分別加入10 μmol·L-1DCFH-DA、5 μmol·L-1HPF、5 μmol·L-1DHR 123或10 μmol·L-1DAF-FM探針預處理30 min，隨后加入終濃度為1 mmol·L-1MPP+誘導6 h。用Hanks緩沖液洗滌3次，加入100 μL Hanks緩沖液，多功能酶標儀檢測熒光值，檢測完成后，加入10 μL MTT(5 g·L-1)，4 h后于570 nm檢測OD值。檢測的熒光值與OD值的比值為每孔的相對熒光強度。

2.5動物分組及模型建立隨機將C57BL/6小鼠分為5組，每組6只，分別為對照組、MPTP組、PBN低劑量組(50 mg·kg-1)、PBN高劑量組(100 mg·kg-1，PBN劑量按文獻[9]設定)和司來吉蘭組(10 mg·kg-1)。稱量記錄動物體質量，MPTP組、PBN低、高劑量組和司來吉蘭組動物按照10 mL·kg-1劑量腹腔注射MPTP·HCl(溶解于生理鹽水，MPTP·HCl 35.1 mg·kg-1，含MPTP量為30 mg·kg-1)，對照組腹腔注射等量的生理鹽水。連續(xù)注射5 d，每天1次，然后正常條件下飼養(yǎng)3 d，使MPTP完全代謝為其活性分子MPP+，即此階段為誘導動物模型，未給予藥物預防。根據分組情況分別給予不同藥物處理7 d，對照組與MPTP組小鼠給予等量生理鹽水，PBN組和司來吉蘭組分別給予對應劑量藥物。在d 7麻醉并處死小鼠，快速分離并提取紋狀體和黑質。

2.6黑質多巴胺神經元的檢測腦組織切片以及免疫組化按文獻報道方法[2]。組織切片置于60℃烘箱1 h后，切片放入3% H2O2避光封閉10 min，去除腦組織切片中的過氧化物酶，然后在0.05 mol·L-1檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中進行微波抗原修復，高火5 min，中火10 min。待自然冷卻至室溫后，加入含有1%的Trion X-100室溫通透30 min，然后10% FBS封閉1 h，直接加入TH(1 ∶1 000)一抗，4℃孵育過夜。切片輕輕放入PBS溶液中洗2次，每次5 min，加入FITC標記的二抗(1 ∶1 000)，室溫避光孵育1 h，甲苯透明化處理2次，每次5 min，擦去切片上殘留液體，滴加熒光抗猝滅劑，蓋上蓋玻片，封片。倒置熒光顯微鏡顯微拍照，統(tǒng)計黑質多巴胺神經元的數量。

2.7紋狀體內DA、高香草酸(HVA)及3,4-二羥苯乙酸(DOPAC)含量的檢測小鼠雙側紋狀體稱重后，按10 mL·g-1加入0.1 mol·L-1高氯酸提取液，冰浴勻漿后12 000 r·min-1離心15 min，取上清液備用。采用Agilent C18反相色譜柱(150 mm×3 mm，4.6 μm)，流動相：甲醇/水=10/90，水相中含有0.05 mol·L-1NaH2PO4、0.027 mmol·L-1EDTA、0.74 mmol·L-1辛烷磺酸鈉、2 mmol·L-1KCl，流速1 mL·min-1，柱溫33℃，檢測電壓0.52 V，流動相pH調節(jié)為3.5，精確吸取20 μL注入色譜儀分析，以各標準品的濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸。

2.8抗氧化蛋白Nrf2和HO-1的檢測小鼠中腦黑質部位稱重，按照10 mL·g-1加入含1 mg·L-1PMSF的RIPA裂解液，冰浴勻漿3 min，然后于4℃、12 000r·min-1離心15 min，取出上清液，BCA蛋白定量，上清液中加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min進行變性。按30 μg蛋白上樣，用SDS-PAGE分離。電泳后，半干式轉膜儀恒壓20 V轉膜1 h，經5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入抗Nrf2和抗HO-1一抗(1 ∶1 000)，置于4℃過夜。室溫下孵育辣根過氧化物酶標記的二抗2 h后，采用化學發(fā)光顯影，凝膠成像儀顯示蛋白條帶，并分析目標條帶灰度。

3 結果

3.1PBN能有效清除非細胞體系自由基利用化學方法模擬機體內自由基生成體系，對PBN的自由基清除活性進行了評價。如Fig 1所示，PBN對非細胞體系的·OH和ONOO-自由基均具有較強的清除能力，且呈濃度依賴性增加。當PBN濃度達到10 μmol·L-1時，對·OH和ONOO-自由基的清除率依次為83%和79%。

3.2PBN保護MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷線粒體復合物Ⅰ的抑制劑MPP+能引起阻斷線粒體呼吸鏈，造成氧化損傷，導致神經元死亡，從而被廣泛應用于抗帕金森病藥物體外神經保護活性的篩選。通過MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷模型，我們對PBN的神經保護活性進行了初步評價。如Fig 2所示，1 mmol·L-1MPP+誘導24 h后，細胞存活率約42%，與正常對照組比較差異有顯著性(P<0.01)； PBN(0.1、1、10 μmol·L-1)預保護2 h，與模型組比較，細胞存活率明顯提高(P<0.05)，當PBN濃度為10 μmol·L-1時，其保護作用最強，細胞存活率到達了60%。

Fig 1 Free radical scavenging activity of PBN in cell free

Fig 2 Effects of PBN on MPP+-induced cell viability in SH-SY5Y )

Cells were pretreated with different concentrations of PBN (0.1 to 10 μmol·L-1) for 2 h, and then exposed to 1 mmol·L-1MPP+for 24 h. Cell viability was examined by MTT assay and the data were from three independent experiments.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsMPP+treated group.

3.3PBN抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞內自由基生成線粒體功能紊亂導致的氧化應激是細胞發(fā)生死亡的重要因素。考慮到PBN在體外非細胞體系中表現出良好的自由基清除活性，我們推測PBN同樣能夠清除神經元內自由基，降低氧化損傷，保護神經元。通過各種細胞內自由基熒光探針，我們對MPP+誘導的細胞內自由基水平進行了檢測。如Fig 3所示，加入 1 mmol·L-1MPP+誘導6 h 后，與正常對照組比較，細胞內H2O2(DCF)、·OH(HPF)、NO(DFA)、ONOO-(DHR123)水平分別升高了約1.7倍、1.6倍、1.9倍、1.4倍(P<0.01)。PBN(0.1、1、10 μmol·L-1)預保護2 h后，細胞內H2O2、·OH、NO、ONOO-呈現濃度依賴性下降，當PBN濃度為10 μmol·L-1時，分別降低到1.2、1.1、1.3、1.1倍，與模型組比較差異具有顯著性(P<0.01)。表明PBN能夠明顯抑制MPP+誘導的神經元內自由基的生成。

3.4PBN降低MPTP誘導的黑質部TH陽性神經元損傷對TH進行特異性熒光染色表明(Fig 4A)，模型組給予MPTP后，黑質中的TH陽性神經元數目明顯減少，明顯低于生理鹽水組。給予PBN(50、100 mg·kg-1)治療后，TH陽性神經元數目較MPTP組明顯增加(Fig 4B)，在PBN高劑量組(100 mg·kg-1)，其作用甚至強于陽性藥司來吉蘭。結果表明，PBN能明顯降低MPTP對黑質中多巴胺神經元的損傷，提高黑質多巴胺神經元數目。

3.5PBN提高紋狀體中DA及其代謝產物的含量通過HPLC-ECD對小鼠紋狀體內DA及其代謝產物含量進行了測定。Fig 5結果表明，模型組小鼠紋狀體中DA及其代謝產物的含量較正常對照組明顯降低，PBN給藥1周后，給藥組的紋狀體內DA、多巴烯(DOPAC)、高香草酸(HVA)較模型組明顯升高，說明PBN能夠逆轉MPTP誘導的DA損傷，增加PD小鼠腦內DA及其代謝產物DOPAC、HVA的含量。檢測DA、DOPAC、HVA標準品的回歸方程及相關系數(R2)如下，DA：Y=3.721 6X+0.831 4(R2=0.999 9)；DOPAC：Y=6.821 3X+1.342 1(R2=1)；HVA：Y=1.206 8X+13.584(R2=0.999 9)。

3.6PBN提高MPTP誘導的PD模型黑質區(qū)Nrf2和HO-1蛋白的表達Nrf2-ARE通路在抗氧化應激方面發(fā)揮重要作用，為進一步明確PBN保護黑質區(qū)TH神經元的作用機制，Western blot檢測了黑質區(qū)Nrf2和HO-1蛋白的表達。如Fig 6所示，MPTP明顯降低了小鼠中腦黑質組織Nrf2和HO-1蛋白表達；PBN(50、100 mg·kg-1)能夠明顯提高Nrf2和HO-1蛋白表達，抑制MPTP的下調作用。該結果表明，PBN的神經保護作用至少部分依賴于激活Nrf2-ARE通路，提高下游HO-1蛋白表達實現。

Fig 3 PBN attenuated MPP+-induced oxidative )

SH-SY5Y cells were pretreated with different concentrations of PBN (0.1 to 10 μmol·L-1) for 2 h, and then exposed to 1 mmol·L-1MPP+for 6 h supplement contained with fluorescent probes for 0.5 h. Fluorescence was examined using Fluorescence Microplate Reader.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsMPP+treated group.

Fig 4 PBN attenuated loss of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned

A：Representative microphotographs of dopaminergic(TH-positive) neurons; B: The number of TH-positive neurons.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsMPTP group.

Fig 5 Effects of PBN on levels of DA and its metabolites DOPAC and HVA in striatum of MPTP-treat )

DOPAC: 3, 4-dihydroxyphenylacetic acid; HVA: Homovanillic acid.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsMPTP group.

4 討論

ROS生成過多導致的氧化應激是PD的主要病因之一，ROS異常生成和累積的最終結果是導致大腦黑質部位多巴胺能神經元的損傷和死亡[10]。因此，抑制自由基生成、清除自由基是治療PD的重要靶點之一。PBN同時具有親脂性與親水性，能夠輕易的穿透組織屏障，到達包括腦組織在內的機體組織，并通過其碳-氮鍵與自由基結合后生成無毒的氮氧化合物被代謝和排泄，從而降低氧化損傷[7]。在所有的自由基中，對組織損傷最厲害的是·OH和ONOO-[2]。文獻報道[11]，PBN能夠快速有效的清除·NO、·OH、O2·-等，但是對于ONOO-的清除能力則沒有直接的報道。本研究結果表明，PBN不僅在非細胞體系中對化學誘導的ONOO-有較強的清除能力(在10 μmol·L-1時，清除率達到80%左右)，在MPP+誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷模型中，PBN也能明顯降低細胞內ONOO-的水平。同時，PBN還能明顯抑制MPP+誘導的細胞內·NO、·OH、O2·-自由基水平升高，提高細胞存活率?？紤]到MPP+主要通過阻斷細胞線粒體呼吸鏈引起氧化損傷產生毒性，我們可以肯定，PBN的神經保護活性與其清除自由基，降低氧化損傷的能力相關。

Fig 6 Effect of PBN on protein expression of Nrf2 and HO-1 in SNpc of MPTP-treated

A: Representative blots of Nrf2 and HO-1 protein expression; B: Densitometric analysis of blots.

MPTP誘導的PD模型是目前常用的PD動物模型之一，它在腦內通過單胺氧化酶的氧化生成MPP+，結合到神經元線粒體呼吸鏈，從而產生毒性作用[12]。腦內多巴胺能神經元的進行性退化、死亡造成腦內DA含量降低是PD最重要的致病機制之一，通過對大腦黑質致密部多巴胺能神經元的計數和黑質-紋狀體區(qū)域多巴胺含量的檢測，可以直觀地判斷化合物對PD的治療作用。TH催化氨基酸 L-酪氨酸形成多巴，是DA合成的限速酶[13]。本研究表明MPTP造模后，小鼠大腦黑質區(qū)域TH陽性神經元數目明顯降低，而與此對應的是，黑質-紋狀體區(qū)域的DA及其代謝產物含量明顯下降，經PBN治療后，TH陽性神經元數目有所回升，而DA及其代謝產物含量也有明顯提高。表明PBN降低了MPTP誘導的氧化損傷，對多巴胺能神經元起到了保護作用。

氧化失衡一方面包括氧化系統(tǒng)的過度活化導致自由基生成過量，另一方面包括還原體系的弱化，使自由基不能及時清除而堆積。轉錄因子Nrf2調控著II相解毒酶和抗氧化酶的活性，同時調控著線粒體呼吸鏈的正常功能[14]，Nrf2含量降低能進一步提高氧化損傷，降低多巴胺能神經元對神經毒素的抵抗能力。研究已經證實，Nrf2過表達可以減輕6-OH DA對多巴胺神經元損傷[15]。越來越多的研究表明，HO-1是Nrf-2下游調控的重要的抗氧化蛋白之一。HO-1過表達可以保護細胞對過氧化氫引起的氧化性損傷，還可以保護黑質多巴胺神經元，減輕MPP+的毒性損傷[16]。在本研究中，模型組小鼠給予MPTP后，Nrf2與HO-1表達與正常組比較均有明顯降低，而不同劑量的PBN治療后，Nrf2與HO-1的含量均有明顯增加，表明PBN在MPTP誘導的PD模型中的神經保護作用至少部分依賴于其能夠刺激Nrf2/HO-1信號通路。

綜上所述，PBN一方面通過抑制細胞內ROS的產生，降低氧化損傷，另一方面通過激活細胞內Nrf2/HO-1信號通路，增強細胞內抗氧化系統(tǒng)活性，從而起到神經保護作用。

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