羅捷然，趙 蓓，唐 莉，葛 睿，李青山,2

(1. 山西醫(yī)科大學藥學院，山西 太原030001 ；2. 山西中醫(yī)藥大學中藥學院，山西 太原 030024)

炎癥是機體受到外界刺激時所產(chǎn)生的損傷和抗損傷的雙重反應，過度或持續(xù)的炎癥反應可引起組織損傷和機能障礙[1-2]，如癌癥、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、慢性炎性腸病、銀屑病等[3-4]。目前，臨床使用的抗炎藥物主要有非甾體類抗炎藥和甾體類抗炎藥兩大類，但服用后的不良反應不容忽視[5-6]。因此，發(fā)現(xiàn)活性更高、副作用更小的新型抗炎藥物仍是該領(lǐng)域的研究熱點。

苯并噁唑酮是一種具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗HIV和骨骼肌松弛等多種生物活性的天然物質(zhì)[7-8]。課題組以苯并噁唑酮為母環(huán)進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并獲得了一系列新型苯并噁唑酮衍生物[9-10]，然而，該類化合物的抗炎作用靶點未知，作用機制尚不明確，嚴重制約了其進一步的合理設計與藥理活性的深入研究。4-(5′-二甲氨基)-萘磺酰氧基苯并噁唑酮(W3D)為課題組設計合成的新型苯并噁唑酮衍生物，其命名及結(jié)構(gòu)見Tab 1，前期活性篩選呈現(xiàn)出較好的體內(nèi)抗炎活性，且較相同劑量陽性藥塞來昔布無明顯差別，然而其抗炎作用機制尚不明確。因此，本研究擬以化合物W3D為小分子探針，采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7作為體外炎癥模型，通過測定炎癥因子的表達評價其體外抗炎活性，并運用Western blot和RT-PCR技術(shù)，從信號通路的調(diào)控方面闡述其抗炎作用機制，為該類化合物的進一步合理設計提供依據(jù)。

Tab 1 Name and structure of the compound W3D

1 材料

1.1細胞株小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2藥品與試劑化合物W3D由課題組合成，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過確證，純度≥98%，用于細胞實驗的W3D均用DMSO溶液配制；DMEM高糖培養(yǎng)基、標準胎牛血清、小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素6(interleukin 6，IL-6) ELISA檢測試劑盒、胞核胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、辣根過氧化物酶標記二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2) ELISA檢測試劑盒(上海西塘生物可以有限公司)；LPS(美國Sigma公司)；Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、磷酸化白細胞介素1受體相關(guān)激酶4(phosphorylated interleukin-1 receptor-associated kinase 4，p-IRAK4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)一抗(CST公司)；RNAiso plus mRNA抽提試劑、熒光實時定量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)。

1.3儀器全波長多功能酶標儀、FQ-PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司)，光學倒置顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限責任公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限責任公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)將RAW264.7細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行實驗。

2.2MTT法檢測化合物W3D對細胞活力的影響待細胞生長至90%，分別加入培養(yǎng)液、溶劑(DMSO)、W3D(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去細胞上清液，每孔加入0.1 mL MTT(5 g·L-1)，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清后，每孔加入0.1 mL DMSO，振蕩, 490 nm處檢測吸光度，并計算細胞存活率。

2.3ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的含量將對數(shù)期細胞接種于24孔板，待細胞密度長至70%～80%，隨機分為空白對照組、模型組(1 mg·L-1LPS)、陽性藥物組(25 μmol·L-1塞來昔布與LPS共同作用)、化合物組(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1W3D與LPS共同作用)，培養(yǎng)24 h后，吸取上清，采用ELISA法，檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的含量，并計算其IC50值。

2.4Westernbolt法檢測IL-6、TLR4、MYD88、p-IRAK4和NF-κB的蛋白表達分別收集空白對照組，模型組(1 mg·L-1LPS)，化合物組(12.5、25、50 μmol·L-1W3D與LPS共同作用)細胞，PBS沖洗后，離心，收集細胞，用含有1% PMSF的RIPA高效細胞裂解液提取細胞蛋白， BCA法進行蛋白定量。于SDS-PAGE電泳進行蛋白分離，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2～3 h，一抗孵育，4℃過夜，二抗孵育1 h，ECL超敏顯影液顯影，檢測IL-6、TLR4、MyD88、p-IRAK4的蛋白表達。依照上述方法，采用胞質(zhì)、胞核蛋白提取試劑，分別提取胞質(zhì)與胞核蛋白，并進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗和顯影，檢測胞質(zhì)、胞核中NF-κB的蛋白表達。以β-actin為內(nèi)參，并用灰度值計算目標蛋白的相對表達量。

2.5實時熒光定量PCR檢測TLR4、MyD88、IL-6mRNA的表達將對數(shù)期細胞接種至6孔板，24 h后隨機分為空白對照組、模型組(1 mg·L-1LPS)、化合物組(12.5、25、50 μmol·L-1W3D與LPS共同作用)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，RNAiso plus mRNA抽提試劑抽提細胞總RNA，按照試劑盒說明步驟去除DNA雜質(zhì)，進行反轉(zhuǎn)錄和擴增。采用實時熒光定量PCR方法，以GAPDH為參照基因，檢測細胞中TLR4、MyD88、IL-6基因的相對表達。所有引物均由上海生工生物工程公司合成，引物序列見Tab 2。

Tab 2 Primer sequence of quantitative real-time PCR

3 結(jié)果

3.1化合物W3D對RAW264.7細胞活力的影響如Fig 1所示，化合物W3D在0～100 μmol·L-1濃度下對RAW264.7細胞無明顯毒性，其細胞活力與空白對照組相比差異無顯著性。

Fig 1 Effects of W3D on viability of RAW264.7

3.2W3D對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的影響如Fig 2所示，

Fig 2 Effects of W3D on the release amount of IL-6(A), TNF-α (B), IL-1β(C) and COX-2(D) in RAW264. 7 cells stimulated by LPS ##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs LPS group

化合物W3D對細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中對IL-1β的抑制作用(IC50為20.07 μmol·L-1)與陽性藥塞來昔布(IC50為17.94 μmol·L-1)比較差異無顯著性，對IL-6的抑制作用(IC50為8.686 μmol·L-1)明顯高于塞來昔布(IC50為36.31 μmol·L-1)，呈現(xiàn)出較好的抗炎活性。但其對LPS所誘導的COX-2上調(diào)并無明顯抑制作用。

3.3W3D對LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-6、TLR4、MyD88、p-IRAK4和NF-κB蛋白表達的影響如Fig 3所示，與空白對照組相比，LPS可明顯上調(diào)RAW264.7細胞中炎癥效應蛋白IL-6和TLR4-NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-IRAK4、MyD88的表達。化合物W3D的干預則可抑制IL-6、TLR4、MyD88的表達，抑制IRAK4的磷酸化，同時可抑制NF-κB的入核活化，且呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系。

3.4W3D對LPS誘導的RAW264.7細胞中TLR4、MyD88、IL-6mRNA表達的影響如Fig 4所示，LPS可明顯上調(diào)RAW264.7細胞TLR4、MyD88、IL-6 mRNA的表達，而化合物W3D則對TLR4、MyD88、IL-6 mRNA的表達有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。

4 討論

炎癥因子在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其中最為關(guān)鍵的炎癥因子有TNF-α、IL-1β和IL-6。TNF-α是炎癥反應過程中出現(xiàn)最早的炎性介質(zhì)，可影響其他炎性因子的合成與釋放，對機體組織代謝也具有重要的調(diào)節(jié)作用[11]。IL-1β與IL-6則參與機體的免疫應答，是炎性反應的促發(fā)劑。因此，抑制炎癥因子的表達則可實現(xiàn)抗炎作用。實驗結(jié)果表明，W3D可明顯抑制小鼠RAW264.7巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達，尤其對IL-6的抑制活性明顯優(yōu)于陽性藥塞來昔布，但該化合物對COX-2卻沒有抑制作用，因此，探究其抗炎作用機制并發(fā)現(xiàn)作用靶點將為該類藥物的進一步研究提供重要依據(jù)。

A: The protein levels of IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells treated with W3D; B: The protein levels of TLR4, p-IRAK4 and MyD88 in LPS-induced RAW264.7 cells treated with W3D; C: The protein levels of total cellular NF-κB, nucleus and cytoplasm NF-κB in LPS-induced RAW264.7 cells treated with W3D in LPS-induced RAW264.7 cells treated with W3D.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

Fig 4 Effects of W3D on the mRNA expression of TLR4, MyD88 and IL-6 on RAW264. 7 cells

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在炎癥中發(fā)揮重要作用，IL-6、IL-1β、TNF-α等在炎癥反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用，細胞因子的轉(zhuǎn)錄表達都可以由激活的NF-κB調(diào)控[12-13]，而TLR4則是激活NF-κB最主要的跨膜信號轉(zhuǎn)運蛋白。本實驗結(jié)果顯示，化合物W3D可明顯降低TLR4 的蛋白與mRNA表達水平，同時可抑制NF-κB的入核活化，因此，該化合物主要通過對TLR4-NF-κB信號通路的調(diào)控而發(fā)揮抗炎作用。

TLR4 可通過髓化分子(MyD88)途徑與非髓化分子途徑來實現(xiàn)對NF-κB調(diào)控作用，其中TLR4-MyD88-IRAK4-NF-κB信號通路是最為重要的炎癥信號通路。TLR4可識別外界(LPS)炎性刺激，將胞外炎性信號轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)重要銜接蛋白MyD88，接受到信號的MyD88可募集IRAK4，致使IRAK4磷酸化激活，通過下游一系列信號傳遞，最終使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)生磷酸化修飾活化入核，進而啟動炎性因子的轉(zhuǎn)錄，使得炎性因子大量產(chǎn)生與釋放，從而促進炎癥反應的發(fā)生與發(fā)展[14-15]。本實驗結(jié)果顯示，化合物W3D可以明顯降低MyD88的蛋白與mRNA的表達，抑制IRAK4的磷酸化激活和NF-κB蛋白的入核活化，進而減少炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放，發(fā)揮抗炎活性。因此，化合物W3D可能是通過對TLR4-MyD88-IRAK4-NF-κB信號通路的調(diào)控而發(fā)揮抗炎活性。

綜上所述，化合物W3D可以通過調(diào)控LPS所激活的TLR4-MyD88-IRAK4-NF-κB炎癥信號通路，抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，從而發(fā)揮抗炎活性，且其對IL-6的抑制作用明顯強于塞來昔布，呈現(xiàn)出較好的開發(fā)前景，但其抗炎作用機制還需進行更深入的研究。

(致謝:本文所有實驗均在山西醫(yī)科大學藥學院藥物化學實驗室進行，在此對實驗參加人員表示衷心的感謝！)

[1] 杜臻雁, 唐福林. 糖皮質(zhì)激素抗炎作用機制的研究進展[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2006,86(35): 2512-5.

[1] Du Z Y, Tang F L. The progress and advances in studies on the anti-inflammatory mechanisms of glucocorticoid [J].NatlMedJChina, 2006,86(35): 2512-5.

[2] Qin J J, Wang W, Zhang R W. Novel natural product therapeutics targeting both inflammation and cancer [J].ChinJNatMed, 2017,15(6): 401-16.

[3] 于水蓮, 陶 怡, 王羿升, 等. 炎癥因素與早期類風濕關(guān)節(jié)炎心血管病變相關(guān)性研究[J]. 中華風濕病學雜志, 2016,20(11): 739-45.

[3] Yu S L, Tao Y, Wang Y S, et al. The correlation between inflammatory burden with cardiovascular diseases in patients with early rheumatoid arthritis [J].ChinJRheumatol, 2016,20(11): 739-45.

[4] Kim Y, Ahn C, Je J. Anti-inflammatory action of high molecular weight Mytilus edulis hydrolysates fraction in LPS-induced RAW264.7 macrophage via NF-κB and MAPK pathways [J].FoodChem, 2016,202:9-14.

[5] A Martelli, L Testai, M Anzini, et al. The novel a-inflammatory agent VA694, endowed with both NO-releasing and COX2-selective inhibiting properties, exhibits NO-mediated positive effects on blood pressure, coronary flow and endothelium in an experimental model of hypertension and endothelial dysfunction [J].PharmacolRes, 2013,78: 1-9.

[6] Elsaman T, Aldeeb O A A, Aboul-Fadl T, et al. Synthesis, characterization and pharmacological evaluation of certain enzymatically cleavable NSAIDs amide prodrugs [J].BioorgChem, 2017,70: 144-52.

[7] Deng B L, Cullen M D, Zhou Z G, et al. Synthesis and anti-HIV activity of new alkenyldiaryl-methane(ADAM)non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors(NNRTIs) incorporating benzoxazolone and benzisoxazole rings [J].BioorgMedChem, 2006,14(7): 2366-74.

[8] Tang L, Ma W, Ma Y, et al. Synthesis and biological activity of 4-substituted benzoxazolone derivatives as a new class of sEH inhibitors with high anti-inflammatory activity in vivo [J].BioorgMedChemLett, 2013,23(8): 2380-3.

[9] 唐 莉, 班樹榮, 林文瀚, 等. 天然產(chǎn)物4-O-B-D-葡萄糖-苯并噁唑酮及4-取代苯并噁唑酮類衍生物的合成與其活性研究[J]. 中國藥物化學雜志, 2009,19(1): 31-5.

[9] Tang L, Ban S R, Lin W H, et al. Synthesis and activities of natural product 4-O-β-D-glucopyranosyl-benzoxazolin-2(3H)-one and derivatives of 4-substituted benzoxazolone [J].ChinJMedChem, 2009,19(1): 31-5.

[10] 羅捷然, 唐 莉, 葛 睿, 等, 新型苯并噁唑酮類衍生物4-鄰甲基苯磺酰氧基-苯并噁唑酮(MBB)抗炎作用的研究[A]. 中國藥學會第十三屆青年藥學科研成果交流會論文集[C]. 2016: 5.

[10] Luo J R, Tang L, Ge R, et al. Study on anti-inflammatory effect of 4-(2-methylphenylsulfonyloxy)-2(3H)-benzoxazolone(MBB) [A]. Conference proceedings of the thirteenth session of National youth pharmaceutical scientific research achievement exchange of China pharmaceutical association[C]. 2016: 5.

[11] 陳煥琦, 張子恒, 周 磊, 等. OSAHS 患者圍手術(shù)期應用西吡氯銨含片的療效研究[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2017,31(14): 1123-6.

[11] Chen H Q, Zhang Z H, Zhou L, et al. Effect of cetylpyridinium chloride Buccal tablets on perioperative application of OSAHS patients [J].JClinOtorhinolarynglolgyHeadNeckSurg, 2017,31(14): 1123-6.

[12] Suzuki A, Hanada T, Mitsuyama K, et al. CIS3/SOCS3/SSI3 plays a negative regulatory role in STAT3 activation and intestinal inflammation [J].JExpMed, 2001,193(4): 471-81.

[13] 李德川, 鮑秀琦, 張德武, 等. 去氫丹參新酮對神經(jīng)炎癥的抑制作用及機制研究[J]. 中國藥理學通報, 2016,32(2): 177-83.

[13] Li D C, Bao X Q, Zhang D W, et al. The anti-neuroinflammatory effects of dehydromiltirone and related mechanisms [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(2): 177-83.

[14] Woo H J, Lee J Y, Park H S, et al. Anti-inflammatory action of 2-carbomethoxy-2, 3-epoxy-3-prenyl-1, 4-naphthoquinone (CMEP-NQ) suppresses both the MyD88-dependent and TRIF-dependent pathways of TLR4 signaling in LPS-stimulated RAW264. 7 cells [J].JEthnopharmacol, 2017,205: 103-15.

[15] 雷升萍, 王 靚, 龍子江, 等. 黃精多糖通過 TLR4-MyD88-NF-κB 通路抑制缺氧/復氧 H9c2 心肌細胞炎性因子釋放[J]. 中國藥理學通報, 2017,33(2), 255-60.

[15] Lei S P, Wang L, Long Z J, et al. Inhibitory effect of polygonatum sibiricum polysaccharides release of inflammatory cytokines of anoxia/reoxygenation H9c2 myocardial cells through TLR4-MyD88-NFκB signaling pathway [J].ChinPharmacolBull, 2017,33(2), 255-60.