方婷婷，曹瑞平，王文連，葉紅偉，吳金欣，谷小雨，高 琴

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室、2. 第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科、3. 臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；4. 陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院麻醉科，陜西 咸陽 712000)

近年來，糖尿病(diabetes mellitus，DM)在全球發(fā)病率逐年上升，并伴發(fā)多種臟器并發(fā)癥，是嚴(yán)重危害人類生活質(zhì)量的慢性疾病之一[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，心肌纖維化是DCM最常見的病理改變之一[2]，其發(fā)生與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白堆積密切相關(guān)[3]。國內(nèi)外研究多集中于心肌成纖維細(xì)胞導(dǎo)致的纖維化發(fā)生，關(guān)于心肌細(xì)胞纖維化的機(jī)制報(bào)道較少。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrx metalloproteinases，MMPs)與組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue matrix metalloproteinase inhibitors，TIMPs)調(diào)控ECM的降解，MMPs/TIMPs平衡紊亂會(huì)引起ECM改變，參與心肌纖維化的發(fā)生。DCM心室重構(gòu)的發(fā)生與高血糖引起的氧化應(yīng)激及MMPs/TIMPs比例失衡密切關(guān)聯(lián)[4]。MMPs/TIMPs比例失衡是否參與高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷呢？這是我們的關(guān)注點(diǎn)之一。

線粒體乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)主要存在于線粒體基質(zhì)，可氧化醛類物質(zhì)為無毒代謝產(chǎn)物。ALDH2基因突變與糖尿病、心血管疾病等密切相關(guān)。前期我們觀察到冠心病合并糖尿病患者ALDH2基因突變型組高血壓發(fā)生率高于野生型組，ALDH2基因突變?cè)黾恿烁哐獕旱陌l(fā)病率，且與高胰島素血癥、胰島素抵抗等有一定的協(xié)同作用。國內(nèi)外先后報(bào)道，ALDH2基因突變的糖尿病患者易出現(xiàn)更嚴(yán)重的心室舒張功能障礙；ALDH2基因敲除糖尿病小鼠亦出現(xiàn)心室舒張功能障礙、代謝儲(chǔ)備失代償和能量代謝紊亂；ALDH2基因敲除小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的因壓力超負(fù)荷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等引起的心臟功能障礙。我們還觀察到，激動(dòng)ALDH2在大鼠心肌缺血/再灌注損傷及糖尿病大鼠心肌損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，可能與減輕氧化應(yīng)激和心肌纖維化、抑制凋亡發(fā)生等有關(guān)[5]。但ALDH2與MMP通路在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究首先觀察激動(dòng)ALDH2是否減輕高糖誘導(dǎo)的原代大鼠心肌細(xì)胞損傷，進(jìn)一步分析ALDH2與MMP-14、TIMP-4在糖尿病心肌損傷中的關(guān)系。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Sprague Dawley(SD)乳鼠1～3 d，來源于蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙 2014-0001)。

1.2藥品與試劑F12培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)基、低糖培養(yǎng)基均購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；HBSS緩沖液、細(xì)胞蛋白提取液、蛋白酶抑制劑(PMSF)、含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液、蛋白定量試劑盒等，均購于上海碧云天生物公司；II型膠原酶、DNA酶I、二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)、MTT、5-Brdu購于美國Sigma公司；小鼠抗大鼠橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin，α-SA)抗體、FITC標(biāo)記的二抗IgG、兔抗大鼠GAPDH購自湖北武漢博士德生物公司；兔抗大鼠ALDH2抗體、MMP-14抗體、TIMP-4抗體購自美國Abcam公司；曝光液購于美國Millipore公司。

1.3儀器酶標(biāo)儀(美國BioTek Epoch儀器公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Western blot儀器、ChemiDo-cTMToch Image Syste化學(xué)發(fā)光儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)取乳鼠心尖部組織，放于預(yù)冷的HBSS液中，輕輕擠壓出血，進(jìn)行清洗，將心臟組織塊剪碎成黏稠狀，再加入混合酶(終濃度分別為0.07%的含EDTA的胰蛋白酶、0.08%的II型膠原酶、10 mg·L-1的DNA酶I)消化，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置7～10 min，棄去渾濁上清。重復(fù)以上消化步驟約5～8次，直至心肌組織蓬松。加入等體積預(yù)冷的含10% FBS的低糖培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打剪碎的組織6～10次，靜置，待大塊組織沉淀后，吸取渾濁上清液入另一離心管中，放入4℃冰箱以保持細(xì)胞活力。重復(fù)以上步驟，直至組織完全被吹散，收集的細(xì)胞混合液1 000 r·min-1離心6 min，獲取細(xì)胞沉淀。低糖培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸。將細(xì)胞種入60 mm培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min后，小心吸取培養(yǎng)液，1 000 r·min-1離心6 min，獲取細(xì)胞沉淀，含10% FBS的F12培養(yǎng)基將其重懸，再加入5-Brdu(工作濃度為0.1 mmol·L-1，抑制混合的成纖維細(xì)胞生長)，種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)一步增加心肌細(xì)胞純度。倒置顯微鏡下觀察貼壁生長的心肌細(xì)胞，起初為點(diǎn)狀圓形，然后為梭形，培養(yǎng)至d 3～4，細(xì)胞互相接觸交錯(cuò)，出現(xiàn)同步化搏動(dòng)。

2.2大鼠心肌細(xì)胞鑒定將原代心肌細(xì)胞爬片，用PBS液輕柔清洗，4%的多聚甲醛37℃固定30 min，PBS液清洗，0.5% Triton X-100 37℃孵育30 min，PBS液清洗，5%的BSA 37 ℃封閉30 min，PBS液清洗，α-SA抗體(1 ∶300)4℃孵育過夜。次日清洗后，加入FITC-羊抗小鼠IgG(1 ∶59)，37℃孵育40 min，PBS液清洗3次，每次5 min，加入DAPI(1 mg·L-1)染細(xì)胞核15 min，甲醇漂洗1次、5 min，PBS液清洗后，避光條件下，在載玻片上滴加5～10 μL抗熒光衰減劑，熒光顯微鏡下拍照，鏡下可見陽性細(xì)胞胞質(zhì)發(fā)出綠色熒光，即為心肌細(xì)胞，計(jì)算有綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的百分比，重復(fù)3次，推算其純度。

2.3實(shí)驗(yàn)分組含10% FBS的F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞，干預(yù)前予以無血清培養(yǎng)基處理24 h，使其處于同步化狀態(tài)。分別給予不同濃度葡萄糖干預(yù)心肌細(xì)胞，葡萄糖濃度分別為5.5 mmol·L-1(normal glucose concentration，NG)、15 mmol·L-1(middle glucose concentration，MG)、30 mmol·L-1(high glucose concentration，HG)，處理24、48、72 h。MTT測定心肌細(xì)胞活力，確定高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型。

高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型確定后，實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)正常對(duì)照組(normal control group，NG)：心肌細(xì)胞在葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1中培養(yǎng)48 h；(2)NG+Alda-1組：將ALDH2特異性激動(dòng)劑Alda-1加入葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1的完全培養(yǎng)基中，使其終濃度為20 μmol·L-1[12]，培養(yǎng)48 h；(3)高糖組(high glucose，HG)：葡萄糖濃度為30 mmol·L-1的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；(4)HG+Alda-1組：將ALDH2特異性激動(dòng)劑20 μmol·L-1的Alda-1加入葡萄糖濃度為30 mmol·L-1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；(5)高滲組(hypertonic pressure group，HPG)：含 5.5 mmol·L-1葡萄糖+24.5 mmol·L-1甘露醇的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

2.4MTT檢測各處理組細(xì)胞活力心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種在96孔板培養(yǎng)，每組5個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)干預(yù)前，予以無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h。不同葡萄糖濃度分別培養(yǎng)24、48、72 h后，各孔加入20 μL MTT溶液(終濃度0.5 g·L-1)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，產(chǎn)生結(jié)晶，小心去除液體，每孔加入150 μL的DMSO，置于搖床上15～30 min，使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm的吸光度值。確定高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，同樣的方法檢測各干預(yù)組心肌細(xì)胞活力。

2.5DHE檢測心肌細(xì)胞在不同處理組的氧化應(yīng)激水平以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)干預(yù)前，以無血清培養(yǎng)基同步化處理48 h，實(shí)驗(yàn)干預(yù)條件處理48 h后，PBS清洗，按照說明書各孔加入含有DHE的F12完全培養(yǎng)基(DHE終濃度10 μmol·L-1)，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗，4%的多聚甲醛固定10 min，倒置熒光顯微鏡下拍照。使用ImageJ 1.48v軟件計(jì)算出各組圖片的熒光灰度值，進(jìn)行量化分析。

Fig 1 Immune fluorescence identification of rat primary cardiomyocytes (×100) A：DAPI; B：α-SA; C：Merged

2.6Westernblot檢測心肌細(xì)胞中ALDH2、MMP-14、TIMP-4蛋白表達(dá)收集不同批次培養(yǎng)的心肌細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞蛋白提取液(RIPA)和PMSF，提取細(xì)胞總蛋白，按照試劑盒說明書檢測蛋白濃度。獲取的蛋白按照40 μg對(duì)應(yīng)的體積加樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。常溫下5%的脫脂牛奶(脫脂奶粉+TBST液)封閉150 min，分別加入ALDH2抗體(1 ∶4 000)、MMP-14抗體(1 ∶4 500)、TIMP-4抗體(1 ∶2000)、GAPDH抗體(1 ∶5 000)，4℃孵育過夜。次日洗膜后，加二抗IgG(1 ∶8 000)，孵育60 min，TBST洗膜后，凝膠成像系統(tǒng)顯影液曝光。以GAPDH為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度值掃描，分別算出ALDH2、MMP-14、TIMP-4與GAPDH的比值。

3 結(jié)果

3.1免疫熒光鑒定心肌細(xì)胞如Fig 1所示，熒光顯微鏡下胞質(zhì)中呈現(xiàn)綠色熒光(α-SA抗原免疫熒光呈陽性反應(yīng))、DAPI染色胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光的即為心肌細(xì)胞。免疫熒光染色表明，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞為原代心肌細(xì)胞，純度為(97.6±3.4)%。

3.2不同干預(yù)組心肌細(xì)胞活力的改變心肌細(xì)胞干預(yù)24 h后，與NG組比較，MG組心肌細(xì)胞活性無明顯變化，HG心肌細(xì)胞活性降低。心肌細(xì)胞干預(yù)48、72 h后，隨著葡萄濃度增加，與NG相比，MG和HG組心肌細(xì)胞活性均降低；與MG相比，HG心肌細(xì)胞活性明顯降低(Tab 1)，提示葡萄糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷呈濃度依賴性。結(jié)合Yao等[6]報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定以高糖(30 mmol·L-1)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞48 h作為誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞損傷模型。NG組和HPG(高滲組)組心肌細(xì)胞存活率差異無顯著性，提示高滲環(huán)境對(duì)于心肌細(xì)胞活力無明顯影響，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中未開展高滲組的實(shí)驗(yàn)。如Fig 2所示，與NG組比較，HG組細(xì)胞活力下降明顯(P<0.01)；與HG組相比，HG+Alda-1組細(xì)胞活力升高(P<0.01)。NG+Alda-1組與NG組相比無明顯差異。

Tab 1 The activities of primary cardiomyocytes

NG：5.5 mmol·L-1glucose group；MG：15 mmol·L-1glucose group；HG：30 mmol·L-1glucose group.*P<0.05，**P<0.01vsNG；#P<0.05,##P<0.01vsMG

Fig 2 Changes of cell viability in primary cardiomyocytes in different n=6)

**P<0.01vsNG;##P<0.01vsHG

3.3不同干預(yù)組心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的變化熒光探針DHE可穿破活細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，氧化氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，產(chǎn)生氧化乙啶，染色體DNA與其摻和，發(fā)出紅色熒光，依據(jù)紅色熒光強(qiáng)度可判斷各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平情況。與NG組相比，NG+Alda-1組熒光強(qiáng)度無明顯區(qū)別；HG組紅色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01)，提示氧化應(yīng)激水平升高；與HG組相比，HG+Alda-1組中細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.01)，氧化應(yīng)激水平降低(Fig 3)。

Fig 3 Changes of superoxide production in primary cardiomyocytes in different groups by DHE staining(×100)

3.4不同干預(yù)組心肌細(xì)胞ALDH2、MMP-14、TIMP-4蛋白表達(dá)的變化如Fig 4所示，與NG組相比，HG組中ALDH2、MMP-14蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，TIMP-4蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與HG組相比，HG+Alda-1組ALDH2、MMP-14蛋白表達(dá)增高(P<0.01)，TIMP-4蛋白水平降低(P<0.01)。與NG組相比，HG組中MMP-14/TIMP-4比值明顯降低(P<0.01)；與HG組相比，HG+Alda-1組中MMP-14/TIMP-4比值明顯升高(P<0.01)。NG+Alda-1組與NG組相比無明顯差異。

Fig 4 Changes of ALDH2, MMP-14, TIMP-4 protein expressions (A, B) and the ratio of MMP-14/TIMP-4 (C) protein in primary cardiomyocytes n=4)

**P<0.01vsNG;##P<0.01vsHG

4 討論

DM是常見的慢性代謝性疾病，近年來其發(fā)病日趨年輕化[7]。國內(nèi)外大量報(bào)道表明，氧化應(yīng)激是許多病理因素造成心血管損傷的共同機(jī)制，高脂血癥、缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化等病理過程中都存在過量的ROS大量釋放，引起心肌損傷。DCM的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[8]。本研究采用高糖處理大鼠原代心肌細(xì)胞，與正常對(duì)照組相比，心肌細(xì)胞活力明顯下降，DHE熒光染色顯示ROS水平明顯增高，提示高糖干預(yù)引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

ALDH2主要存在于線粒體中，在酒精代謝中起到關(guān)鍵作用，是活性最強(qiáng)的醛類氧化酶，能氧化并清除活性醛類物質(zhì)。ALDH2在糖尿病等病理情況下，對(duì)心肌具有保護(hù)作用[9]。激動(dòng)ALDH2可對(duì)抗多種干預(yù)引起的氧化應(yīng)激損傷。Alda-1是ALDH2的特異性激動(dòng)劑，Chen等[10]首先報(bào)道，特異性激動(dòng)ALDH2可改善心肌缺血/再灌注損傷中氧化應(yīng)激的發(fā)生，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。我們觀察到20 μmol·L-1Alda-1可通過特異性激動(dòng)ALDH2，改善高糖引起的心肌成纖維細(xì)胞損傷[11]。本研究觀察到，與正常對(duì)照組相比，高糖干預(yù)48 h后，心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高，同時(shí)ALDH2蛋白表達(dá)明顯下降；給予Alda-1激動(dòng)ALDH2后，與高糖組相比，心肌細(xì)胞活力明顯升高，氧化應(yīng)激水平明顯降低，ALDH2蛋白水平升高明顯。提示Alda-1通過增加ALDH2的表達(dá)，改善細(xì)胞活力、降低氧化應(yīng)激水平，從而改善高糖刺激引起的心肌細(xì)胞損傷。

MMPs家族的主要作用是降解ECM。MMPs家族目前已知有26個(gè)成員，其中MMP-14除能降解ECM外，還能活化其他MMPs成員。TIMPs與MMPs結(jié)合，特異性抑制MMPs生成，對(duì)抗其降解ECM的作用。目前，已發(fā)現(xiàn)的4種TIMPs中，TIMP-4在心臟中高表達(dá)。DCM大鼠心肌氧化應(yīng)激、心肌間質(zhì)纖維化同時(shí)，MMPs表達(dá)明顯下調(diào)[12]。Felkin等[13]報(bào)道，心臟衰竭患者TIMP-4表達(dá)明顯增高。MMPs/TIMPs的平衡狀態(tài)參與維持ECM正常生理功能，慢性心衰和心肌肥大等病理過程中，MMPs/TIMPs比例失衡，導(dǎo)致基質(zhì)成分改變，引起心肌纖維化。高糖環(huán)境下，細(xì)胞中氧自由基生成增多，脂質(zhì)過氧化、醛類代謝產(chǎn)物生成增多，誘導(dǎo)MMPs家族成員改變。有文獻(xiàn)報(bào)道，氧化應(yīng)激損傷中，醛類代謝產(chǎn)物4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)通過激活線粒體ROS介導(dǎo)的Akt/NF-kB途徑，引起血管平滑肌細(xì)胞MMP-2生成增多[14]；4-HNE濃度依賴性地引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)增多，激動(dòng)ALDH2，減輕肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和4-HNE的生成[15]。本研究中，我們不僅觀察了MMP-14的變化，同時(shí)觀察了心臟高表達(dá)的MMPs抑制劑TIMP-4的改變，更好地分析MMPs通路在心肌損傷中的可能變化。實(shí)驗(yàn)觀察到，與正常對(duì)照組比較，高糖處理組心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激增加。同時(shí)，ALDH2、MMP-14蛋白水平下降，TIMP-4蛋白水平升高，MMP-14/TIMP-4比值下降明顯，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測高糖引起的ALDH2表達(dá)降低和氧化應(yīng)激損傷可能導(dǎo)致心臟高表達(dá)的MMPs抑制劑TIMP-4表達(dá)增加，從而抑制MMP-14在心肌的表達(dá)，間接引起其他MMPs成員表達(dá)降低，心肌基質(zhì)降解受抑制，纖維化加重；與高糖處理組相比，給予Alda-1特異性激動(dòng)ALDH2后，氧化應(yīng)激降低同時(shí)，MMP-14蛋白水平升高，TIMP-4蛋白水平下降，MMP-14/TIMP-4比值回升，提示Alda-1激動(dòng)ALDH2高表達(dá)后，減輕氧化應(yīng)激程度，抑制TIMP-4蛋白表達(dá)，其對(duì)MMP-14的抑制作用減弱，使得MMPs成員對(duì)心肌基質(zhì)降解作用增強(qiáng)，從而保護(hù)心肌。

綜上所述，激動(dòng)ALDH2改善高糖引起的心肌損傷和纖維化的發(fā)生，可能與抑制氧化應(yīng)激、促進(jìn)MMP-14高表達(dá)、抑制TIMP-4表達(dá)有關(guān)。這為研究ALDH2在DCM中起著保護(hù)作用提供了新途徑。但ALDH2與MMPs家族其他成員的關(guān)系及其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。MMP家族不同成員作用不同，作用機(jī)制復(fù)雜，不同MMP成員對(duì)心肌產(chǎn)生的作用及深入機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心心腦血管研究室完成，感謝課題組老師及同學(xué)給予的幫助和支持。)

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