李亞青，可 燕，蔣嘉燁，李漢清，劉佳琪，栗 源，干仲元

(上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition,EndMT)是內(nèi)皮細(xì)胞在特殊生理或病理?xiàng)l件下失去內(nèi)皮細(xì)胞特征，表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特征的過(guò)程，屬于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的一種。其主要特性是細(xì)胞骨架發(fā)生變化，內(nèi)皮細(xì)胞間黏附力逐漸降低直至失去，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白及纖維細(xì)胞特異性蛋白增多[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，多種疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程都涉及到EndMT，如動(dòng)脈粥樣硬化[2]、心肌纖維化[3]、肺動(dòng)脈高血壓[4]等各種心血管疾病。因此，尋找以EndMT為靶點(diǎn)的天然藥物具有非常重要的意義。

黃花烏頭[Aconitumcoreanum(H.Lév.)Raipaics]是毛茛科烏頭屬植物，塊根入藥，中藥名為關(guān)白附、白附子、竹節(jié)白附，具有祛風(fēng)痰、逐寒濕、止痛的功效[5]。20世紀(jì)60年代至今，黃花烏頭的有效成分分離及藥理研究主要集中在生物堿如鹽酸關(guān)附甲素方面[6-7]，關(guān)于其多糖成分的研究很少。本課題組首次從黃花烏頭中分離并鑒定出1種均一多糖(Aconitum coreanum polysaccharides,ACP)，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1A。并且已驗(yàn)證ACP在脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW炎癥模型中，可通過(guò)NF-κB信號(hào)途徑劑量依賴(lài)性地抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、iNOS和IL-6的表達(dá)[8]。本研究擬通過(guò)建立轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)EndMT模型，觀察ACP 抑制EndMT的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞系HUVEC購(gòu)自ATCC(ATCC-CRL-1730TM)。

1.2藥物與試劑黃花烏頭藥材(批號(hào)：150910)，購(gòu)于上海康橋中藥飲片有限公司；ACP為本課題組自制。TGF-β購(gòu)于Peprotech公司；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(endothelial cell growth supplement,ECGS)購(gòu)于Sciencell公司；肝素購(gòu)于Biosharp公司；RIPA、PMSF，購(gòu)于上海威奧生物科技有限公司；CD31抗體(ab64543)購(gòu)自Abcam公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(23081-1-AP)購(gòu)自Proteintech公司；Smad2抗體(D43B4)、p-Smad2抗體(D27F4)、Smad3抗體、p-Smad3抗體(C25A9)，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；DMEM培養(yǎng)基(SH30021.01)購(gòu)于HyClone公司；DPBS、胎牛血清(FBS)、胰酶，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.3儀器超凈臺(tái)(蘇凈安泰)；顯微鏡(日本Olympus公司)；Galaxy 170S CO2培養(yǎng)箱(Eppendorf公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Cellometer Mini細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Nexcelom)；酶標(biāo)儀(Molecular devices)。

2 方法

2.1ACP的制備ACP的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[8]，經(jīng)高效液相測(cè)定含量為98%。用DPBS作為溶劑，超聲溶解，配制成10 g·L-1的母液，加藥前用DMEM培養(yǎng)基分別稀釋成所需濃度。

2.2HUVEC的培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)條件為37℃、95%濕度、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為含10% FBS、肝素、ECGS的DMEM培養(yǎng)基，3～5 d后細(xì)胞融合度到80%～90%時(shí)，采用胰酶進(jìn)行消化、離心、混懸操作，按照1 ∶3比例傳代。

2.3細(xì)胞分組與給藥模型建立：HUVEC分為5組，用濃度為0、1、5、10、20 μg·L-1的TGF-β刺激細(xì)胞，孵育72 h。藥物干預(yù)：HUVEC分為5組，為空白對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)、模型組(10 μg·L-1TGF-β)、給藥組[10 μg·L-1TGF-β+ ACP(50、100、200 mg·L-1)]。孵育72 h。

2.4CCK-8細(xì)胞增殖毒性實(shí)驗(yàn)將HUVEC消化、離心、混懸，加入到96孔板中，每孔100 μL，密度控制在每孔5×103個(gè)細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，采用不同濃度的ACP分別干預(yù)HUVEC，36 h后加入CCK-8試劑，每孔10 μL，孵育4 h，450 nm處測(cè)定吸光度。

2.5劃痕實(shí)驗(yàn)當(dāng)HUVEC融合度到80%～90%時(shí)，接種到12孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后，采用20 μL槍頭在12孔板內(nèi)垂直劃痕，用DPBS輕洗3次，按照“2.3”項(xiàng)下方法分組，無(wú)血清給藥處理24 h后，每組隨機(jī)選擇4個(gè)平行標(biāo)記點(diǎn)，于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，并計(jì)算細(xì)胞遷移距離：遷移距離d=(0 h劃痕的平均面積-24 h劃痕的平均面積)/劃痕長(zhǎng)度。

2.6Westernblot實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基棄去，用DPBS輕洗2遍，加入蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF=50 ∶1)100 μL，冰上裂解5 min，刮板刮下蛋白收集到離心管中，超聲，離心，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量，并由制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出各樣本蛋白的最終濃度，調(diào)整總蛋白含量一致后，加入4×蛋白上樣緩沖液混合，95℃加熱10 min使充分變性。配膠，每孔15 μL進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳(80 V,30 min;120 V,1.5 h)，將蛋白以250 mA、2 h轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，奶粉封閉1 h，相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜。相應(yīng)二抗孵育1 h，TBST洗膜后顯影，使用圖像分析軟件檢測(cè)各組蛋白的相對(duì)密度(以GAPDH為內(nèi)參)。

3 結(jié)果

3.1ACP含量測(cè)定ACP的提取率為0.05%，經(jīng)高效液相測(cè)定含量為98%(Fig 1)。

Fig 1 Structure (A) and HPLC (B) of ACP

3.2ACP對(duì)HUVEC生長(zhǎng)活性的影響Fig 2的CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，不同濃度ACP干預(yù)HUVEC 36 h后，細(xì)胞活性明顯增加(P<0.05)，提示ACP對(duì)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

3.3TGF-β誘導(dǎo)HUVECEndMT模型以不同濃度TGF-β誘導(dǎo)HUVEC EndMT發(fā)生(Fig 3)，當(dāng)TGF-β濃度≥10 μg·L-1時(shí)，內(nèi)皮特異性標(biāo)志物CD31蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-SMA蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。故選用TGF-β(10 μg·L-1)刺激72 h為造模條件。

3.4ACP對(duì)TGF-β誘導(dǎo)HUVEC遷移能力的影響Fig 4劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組在給予10 μg·L-1TGF-β處理后，24 h內(nèi)細(xì)胞遷移率明顯增高，表明TGF-β可以促進(jìn)細(xì)胞遷移；與模型組相比，ACP(50、100、200 mg·L-1)處理24 h內(nèi)細(xì)胞遷移率明顯降低，表明ACP可以抑制由TGF-β引起的細(xì)胞遷移增強(qiáng)，并有劑量依賴(lài)性。

Fig 2 Effects of ACP at various concentrations

*P<0.05vscontrol group

Fig 3 Effects of TGF-β on protein levels of CD31,

A:α-SMA, CD31 expressions were detected by Western blot; B: Density analysis of protein expression.*P<0.05vscontrol group.

3.5ACP對(duì)HUVECEndMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響TGF-β刺激HUVEC后，內(nèi)皮特異性標(biāo)志物CD31蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-SMA蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。與模型組相比，TGF-β與ACP共培養(yǎng)可明顯抑制這種情況，且具有劑量依賴(lài)性(Fig 5)。

Fig 4 Effects of ACP on cell mobility tested by wound

A:ACP suppressed the transfer ability induced by TGF-β; B:Distance migrated of HUVECs.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β-treated cells.

Fig 5 Effects of ACP on expression of CD31, α-SMA in HUVECs induced by

A:ACP inhibited expression of CD31, α-SMA induced by TGF-β; B: Density analysis of CD31 and α-SMA.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β-treated cells.

3.6ACP對(duì)TGF-β/Smad2/3信號(hào)通路的影響為進(jìn)一步探討ACP抑制EndMT的機(jī)制，測(cè)定了TGF-β誘導(dǎo)下Smad2/3及磷酸化Smad2/3的蛋白表達(dá)。Fig 6的Western blot 結(jié)果表明，HUVEC經(jīng)TGF-β誘導(dǎo)后，p-Smad2、p-Smad3表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；經(jīng)ACP處理后，p-Smad2、p-Smad3水平相比于模型組明顯下降(P<0.05)，提示ACP通過(guò)TGF-β/ Smad2/3途徑抑制EndMT。

Fig 6 Effects of ACP on expression of p-Smad2, p-Smad3 in HUVECs induced by

A: Western blot for protein levels of p-Smad2/3 and Smad2/3; B:Quantification of protein levels of p-Smad2/3 normalized to Smad2/3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β-treated cells.

4 討論

心血管疾病是目前人類(lèi)致殘、致死的主要原因之一，器官纖維化則是多種心血管疾病不斷進(jìn)展導(dǎo)致的終末階段，可引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥，導(dǎo)致器官損傷，是目前臨床面臨的治療難關(guān)[9]。因此，抑制器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展是治療心血管疾病的重要環(huán)節(jié)，對(duì)降低心血管疾病的致死風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。近年來(lái)研究表明，EndMT和心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，EndMT可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，形成器官纖維化[10]，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[11]。因此，尋找以EndMT為靶點(diǎn)的天然藥物可能為防治心腦血管疾病提供新的臨床治療思路。

多糖是具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學(xué)活性的天然高分子聚合物，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是近幾年藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。黃花烏頭多糖有抗氧化、抗癌作用，我們前期從中分離純化的多糖ACP具有較好的抗炎作用。在此基礎(chǔ)上，本研究建立TGF-β誘導(dǎo)的HUVEC EndMT模型，考察ACP對(duì)EndMT過(guò)程的干預(yù)作用。結(jié)果顯示，TGF-β誘導(dǎo)能明顯增加細(xì)胞遷移能力，降低內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白CD31表達(dá)，增加間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)，ACP能明顯逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程，且具有劑量依賴(lài)性。

EndMT過(guò)程涉及了多個(gè)調(diào)節(jié)因子，其中TGF-β被認(rèn)為是誘導(dǎo)EndMT發(fā)生的最明確的信號(hào)因子[12]。首先，TGF-β配體與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的TGF-β Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸受體(TβRⅡ)結(jié)合形成異四聚體，活化跨膜I型受體使其磷酸化，激活TGF-β/Smad信號(hào)通路，使其下游細(xì)胞質(zhì)中Smads家族的Smad2 和Smad3蛋白磷酸化形成p-Smad2/3，隨后p-Smad2/3與通用型Smad4 形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，這些雜聚肽Smad 復(fù)合體入核后，通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用來(lái)調(diào)節(jié)Snail、Twist1 和Slug核內(nèi)特異靶基因的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答[13]。本研究結(jié)果表明，經(jīng) TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞72 h后，p-Smad2/3表達(dá)明顯上調(diào)，ACP干預(yù)后可明顯抑制p-Smad2/3表達(dá)。提示ACP對(duì)TGF-β誘導(dǎo)EndMT 有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制Smad2、Smad3磷酸化激活有關(guān)，關(guān)于Snail、Twist1 和Slug等核內(nèi)靶基因指標(biāo)的表達(dá)情況還有待進(jìn)一步研究。

此外，既往研究證實(shí)，炎癥和EndMT有緊密聯(lián)系，Mahler等[14]的研究證明，炎性細(xì)胞因子可通過(guò)Akt/NF-κB通路，誘導(dǎo)胚胎和成年瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。張利霞等[15]研究提示，高糖誘導(dǎo)小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT可能是通過(guò)激活NLRP3炎癥小體，從而增加IL-1β分泌實(shí)現(xiàn)的。本課題組已經(jīng)在體外證實(shí)了黃花烏頭均一多糖ACP良好的抗炎效果，下一步我們也將對(duì)ACP是否能抑制炎癥誘導(dǎo)的EndMT進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)ACP的研究為心血管疾病的新藥開(kāi)發(fā)或者輔助藥物開(kāi)發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研究心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了一些新思路。

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