聶俊，江波，何文杰，朱穎，涂長玲，董堅(jiān)

(云南省腫瘤醫(yī)院，昆明650118)

三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)均為陰性表達(dá)的乳腺癌，約占全部乳腺癌15%～20%[1]。這類乳腺癌由于缺乏特異性靶點(diǎn)，內(nèi)分泌治療與抗HER-2靶向治療無效，目前治療以手術(shù)和放化療為主，但療效不佳，早期局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，總生存率較低，預(yù)后差[2]。微小RNA(miRNA)是一種長約22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，通過結(jié)合到靶基因 mRNA 的 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，從而降解靶基因 mRNA或抑制其翻譯，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程[3]。微小RNA125b(miRNA-125b)可通過其靶基因調(diào)控Wnt[4]、NF-κB[5]、TGF-β[4]、STAT等信號(hào)通路，進(jìn)而影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展。但干擾miRNA-125b表達(dá)對(duì)TNBC細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)通路蛋白表達(dá)情況影響的相關(guān)研究目前較少。本研究觀察了通過轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物的方法干擾TNBC細(xì)胞中miR-125b表達(dá)對(duì)TNBC細(xì)胞MDA-MB-468增殖、凋亡和NF-κB通路蛋白的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑及儀器 人MDA-MB-468細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。補(bǔ)充主要試劑和儀器。10%胎牛血清購自GIBCO公司，DMEM/F12、LTX轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，Trizol試劑盒、miR-125b引物、U6、miR-125b抑制物、miR-125b陰性對(duì)照物購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。MTT購自Signalway公司、蛋白抗體購自Millipore公司。miR-125b抑制序列為5′ -CTCACAAGTTAGGGTCTCAGGG-3′無關(guān)序列的核苷酸序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,均由上海吉瑪公司合成純化。

1.2 MDA-MB-468細(xì)胞分組及miR-125b抑制物轉(zhuǎn)染 MDA-MB-468細(xì)胞用L-15培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，并且融合率達(dá)90%時(shí)傳代。取對(duì)數(shù)生長期MDA-MB-468細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2×105/μL，接種于24孔板，每孔2 mL。將MDA-MB-468細(xì)胞分成miR-125b抑制序列轉(zhuǎn)染組、無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組，每組3孔。miR-125b抑制序列轉(zhuǎn)染組、無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染miR-125b抑制序列、無關(guān)序列，轉(zhuǎn)染試劑均為脂質(zhì)體Lipofectamine，按試劑盒說明書操作?？瞻讓?duì)照組不轉(zhuǎn)染。

1.3 三組細(xì)胞中miR-125b的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h三組細(xì)胞miR-125b。按照Trizol試劑盒說明書提取癌組織和細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件為25℃ 30 mim、42℃ 30 mim、85℃ 10mim，逆轉(zhuǎn)錄試劑由吉瑪公司提供。cDNA 采用SYBR Seclect Master Mix系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-125b的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參。miR-125b正向引物5′- ACTGATAAATCCCTGAGACCCTAAC-3′，反向引物5′- TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCAC-3′，U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ ，反向引物5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-△ △CT表示miR-125b相對(duì)表達(dá)量。

1.4 三組細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。將轉(zhuǎn)染完畢的三組細(xì)胞胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，每孔100 μL含細(xì)胞5 000/孔接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，搖床低速震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在570 mm波長處檢測(cè)吸光度(OD570)，以空白培養(yǎng)基調(diào)零。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 三組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染72 h后，用無EDTA 的0.25%胰酶將細(xì)胞消化成單個(gè)，離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次，再用1×結(jié)合緩沖液制成1×106/mL的懸液。Falcon試管中加入100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC和10 μL 碘化丙啶(PI)染料，輕輕混勻，室溫下避光放置15 min，流式細(xì)胞儀測(cè)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 三組細(xì)胞NF-κBp65、Caspase-3蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。三組細(xì)胞長至80%～90%匯合時(shí)，分別提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入5×Protein Loading Buffer煮沸5 min使蛋白充分變性，-70 ℃保存。以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)泳道上樣40 μg蛋白，進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉2 h，分別加入磷酸化的NF-κB p65、Caspase-3一抗(工作濃度1∶200)4℃孵育過夜，洗膜10 min×3次，加二抗(工作濃度1∶1 000)室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝光顯影。以NF-κB p65、Caspase-3蛋白條帶與β-actin條帶灰度值之比表示NF-κB p65、Caspase-3蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞OD570比較 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)點(diǎn)三組細(xì)胞OD570見表1。轉(zhuǎn)染96、120 h 時(shí)miR-125b抑制序列轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD570低于無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組(P均<0.05)，無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組OD570相比P>0.05。轉(zhuǎn)染24、48、72 h三組細(xì)胞OD570相比P均>0.05。

表1 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)點(diǎn)三組細(xì)胞OD570比較

注：與無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2 三組細(xì)胞凋亡率比較 轉(zhuǎn)染72 h后miR-125b抑制序列轉(zhuǎn)染組、無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為24.85%±2.21%、1.47%±0.78%和1.32%±0.65%。miR-125b抑制序列轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率與無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組相比，P均<0.05，無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比，P>0.05。

2.3 三組細(xì)胞NF-κBp65、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較 三組細(xì)胞NF-κBp65、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量見表2。與無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組相比，miR-125b抑制序列轉(zhuǎn)染組細(xì)胞NF-κBp65相對(duì)表達(dá)量下降(P均<0.05)，Caspase-3相對(duì)表達(dá)量上升(P均<0.05)；無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組細(xì)胞NF-κBp65、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量相比，P均>0.05。

表2 三組細(xì)胞NF-κBp65、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較

注：與無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

乳腺癌是高度異質(zhì)性的腫瘤，早期病理僅從形態(tài)學(xué)的差異進(jìn)行區(qū)分，之后根據(jù)基因表達(dá)譜的不同，將乳腺癌分為管腔A型、管腔B型、正常乳腺樣型、HER2過表達(dá)型、基底細(xì)胞樣型(TNBC屬于此型)5種亞型[6]，各種亞型的生物學(xué)行為不同。miRNA是非編碼小分子RNA，通過對(duì)靶基因的調(diào)控參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。不同乳腺癌亞型中miRNA的表達(dá)存在差異，這些差異與乳腺癌的分期、激素受體表達(dá)水平等因素相關(guān)[7]。在正常乳腺組織中，miR-125b、let7c等8個(gè)miRNAs在基底樣細(xì)胞中的表達(dá)高于管腔型細(xì)胞， miR-200c、miR-21等6個(gè)miRNAs在管腔型細(xì)胞中表達(dá)高于基底樣細(xì)胞，這些在管腔型和基底樣型細(xì)胞間差異表達(dá)的miRNAs被稱為管腔型細(xì)胞特異性miRNA和基底樣細(xì)胞特異性miRNA[8]。在乳腺癌中，所有基底樣細(xì)胞特異性miRNA在管腔型中表達(dá)較低，而miR-125b在具有BRCA-1突變的基底樣乳腺癌和肌上皮樣腫瘤中均高表達(dá)[8]。已有研究表明，miR-125b異常表達(dá)可通過調(diào)節(jié)p53、NF-κB等信號(hào)通路活性，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。但尚未見有關(guān)TNBC的類似研究。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物的TNBC細(xì)胞MDA-MB-468內(nèi)miR-125b的表達(dá)下降、增殖活性降低、凋亡率升高，表明表明miR-125b參與TNBC細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。miR-125b可能是診治TNBC的靶點(diǎn)。

NF-κB是一種具有多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控下游基因的表達(dá)影響細(xì)胞的增殖、炎癥反應(yīng)、侵襲和凋亡，在惡性腫瘤的發(fā)展中具有重要作用。在靜息狀況下，NF-κB連接在IκBs蛋白亞基上，以無活性的形式存于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。被激活后，NF-κB從抑制亞單位上釋放，導(dǎo)致IκB-α被磷酸化并降解，NF-κB p65亞單位轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。NF-κB在TNBC中持續(xù)激活，參與TNBC增殖[9]、轉(zhuǎn)移，并抑制細(xì)胞凋亡[10]。NF-κB激活后，可通過上調(diào)抗凋亡基因FLIP、凋亡抑制蛋白c-IAP1/2和XIAP以及Bcl-2家族成員的表達(dá)[11]，下調(diào)Bax、Fas、Bak等促凋亡蛋白的表達(dá)，抑制Caspase3 的活性，減少腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]。因此，抑制NF-κB的活性可能是治療TNBC的方法。

研究表明，在包括乳腺癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中，NF-κB信號(hào)通路活性與miRNA有關(guān)，如miR-223通過激活NF-κB促進(jìn)肺癌的發(fā)展[13]，而miR-429通過靶向IKKβ，抑制NF-κB通路的活性，使宮頸癌細(xì)胞的生長受抑[14]。多個(gè)miR-125b的靶基因參與NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。miR-125b在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過表達(dá)，可通過抑制其靶基因NF-κB負(fù)性調(diào)節(jié)因子NKIRAS2 和TNFAIP3的表達(dá)，增強(qiáng)NF-κB信號(hào)通路的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生耐藥[5]。miR-125b在鼻咽癌中高表達(dá)，通過作用于靶基因A20激活NF-κB通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[15]。此外，miR-125b的一些靶基因是p53的上游調(diào)控因子，并且miR-125b可直接下調(diào)p53，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物后TNBC細(xì)胞MDA-MB-468內(nèi)NF-κBp65表達(dá)量下降，表明在TNBC中miR-125b可參與NF-κB活性的調(diào)節(jié)。抑制細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)引起的細(xì)胞增殖能力下降和凋亡率增加，可能與NF-κB通路活性受抑制有關(guān)。調(diào)控miR-125b表達(dá)可能通過NF-κB通路對(duì)TNBC發(fā)揮治療作用，這可以作為進(jìn)一步研究的方向。

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